鈍端克隆如何工作的初學者指南

鈍的和黏的可能聽起來枯燥和肮髒，但了解這些不同的克隆方法如何工作是很重要的，當選擇使用哪種方法時。在這裏，我們將為您介紹鈍端克隆的工作原理。

鈍端克隆是將在5 '和3 ' '端(即鈍端)沒有不配對堿基的DNA片段克隆成具有相同線性化的向量。這與黏端克隆不同，黏端克隆中插入和載體都包含彼此互補的單鏈懸垂。鈍端可以通過多種方式產生，例如用T4 DNA聚合酶進行末端修複，其中5 '或3 '單鏈突出的末端被填充，或者更常見的是，通過限製性內切酶在DNA主幹上產生一個直切。鈍端切割機EcoRV是後者的一個很好的例子，下麵我們將看到鈍端克隆是如何工作的，以及它何時可能是克隆項目的正確工具。

為什麼我要使用鈍端克隆?

想象一下，你希望克隆一個PCR產物，在序列的末端和內部包含許多常見的粘性末端限製性內切酶位點，如EcoRI或hindii。在不切斷PCR產物的情況下進行部分消化會產生粘性懸垂(見圖1)，這是很有挑戰性的。(注:隻有當你使用具有校對功能的DNA聚合酶(如Pfu)時，這才成立。我們將在後麵討論鈍端克隆的工作原理)。

考慮另一種情況，如果你想的話基因組DNA的克隆片段經過物理剪切和修複兩端。你可以預期這些末端在核苷酸序列中是隨機的，並且每個末端的核苷酸數量在不同的片段之間有所不同。即使不是不可能，也很難將這些克隆到任何向量的多重克隆位點(見圖2)。然而，在末端修複後，所有的末端都將鈍化，並與鈍端線性化向量兼容。

無論情況如何，鈍端克隆的主要優點是鈍端的普適性，而克隆粘端片段必須考慮到懸垂序列的互補性。

鈍端克隆是如何工作的?

現在讓我們談談鈍端克隆是如何工作的。基本上，鈍端插入物和線性化載體與DNA連接酶混合，當插入物、載體和連接酶在溶液中結合時，反應繼續進行。當連接酶催化一個堿基的3 ' -羥基與相鄰堿基的5 ' -磷酸基之間形成共價鍵時，插入物與載體連接。我們在這裏就不細說了，但你可以看看這個188bet手机版APP咬大小的生物文章DNA連接了解更多有關DNA連接酶機製的細節。

5 ' -磷酸鹽的重要性

在被連接的片段中5 '磷酸的存在是至關重要的，因為5 '磷酸與3 '羥基的共價鍵使載體/插入複合體循環，並允許其在細菌轉化時被克隆。5 ' -磷酸基可以通過使用T4多核苷酸激酶或使用5 '末端核苷酸上的磷酸基合成的PCR引物引入PCR產物、端修複片段或線性化載體(如果尚未存在)。表1顯示了插入物和載體在不同處理後的磷酸化狀態。

雖然5 ' -磷酸基對形成環形結構至關重要，但它們的缺失也可以為你帶來好處。如果你正在使用PCR創建插入物或放大線性化的載體，在克隆過程中，缺乏5 ' -磷酸的PCR引物有助於減少再循環載體的背景。同樣，酶的方法可以用堿性磷酸酶處理DNA片段來去除磷酸鹽。

如何打造你的鈍頭

通過填充物理剪切(見圖2)後剩餘的單鏈懸垂(或使用產生粘性末端的限製性內切酶切割)，可以產生鈍端。單鏈懸垂可以用DNA聚合酶(如T4聚合酶和Klenow片段)的混合物修複。你也可以簡單地用限製性內切酶切割DNA，隻留下鈍的末端。smi和EcoRV是兩種這樣的內切酶，可用於圓形質粒的線性化或切斷粘滯端，留下鈍端準備進行連接(圖3)。

通過PCR產生鈍端

用PCR產生鈍端的一個重要考慮因素是擴增後存在3 '腺嘌呤(A)。Taq聚合酶，缺少3 ' ?5 '校對活動時，會在放大產品的3 '端留下一個A。雖然這是有用的助教克隆，這將防止鈍端結紮。那麼，當使用沒有3 '的PCR聚合酶時?5 '校對活性時，3 '腺嘌呤(A)懸垂必須通過將擴增的材料暴露於具有校對活性的酶來去除。這被稱為PCR拋光，通常使用Pfu聚合酶進行。當然，你也可以首先用Pfu放大你的插入物或載體，以避免3 '腺嘌呤，但這是以速度為代價的。想了解更多關於Taq和Pfu聚合酶的好處，你可以點擊查看這篇bit188bet手机版APPe esize Bio文章。

鈍端結紮時的問題

既然我們已經探討了為什麼要使用鈍端克隆以及鈍端克隆是如何工作的，那麼讓我們討論鈍端連接的一些缺點以及如何克服它們。

鈍端結紮效率較低

與粘端結紮法相比，鈍端結紮法效率較低，事實上，效率低10 - 100倍。這是因為，與黏端克隆不同，在互補核苷酸懸垂之間沒有氫鍵來穩定載體/插入結構的形成。因此，鈍端連接需要更多的連接酶，以及更多的線性化向量和插入。更多並不總是更好，因為過多的連接酶和過多的插入會導致插入連接，甚至多個插入被克隆到載體中。這可能需要對您的連接條件進行一些優化，以使其完全正確。欲了解更多信息，請參閱此188bet手机版APPbite esize Bio關於如何改善鈍端結紮的文章．

潛在的向量Re-Ligation

與這種相對缺乏效率相關的是線性化向量重新連接的可能性，因為分子內連接比分子間連接更有可能發生。這個問題很容易克服，可以在結紮前去磷酸化你的載體，或者用缺乏5 '磷酸的PCR引物放大你的線性化載體。雖然這些方法添加了額外的步驟，但它們有效地解決了這個問題，如果您不關心克隆插入的方向，則可以采用這種方法。

插入可以在兩個方向連接

正如前麵在描述鈍端克隆的工作原理時所提到的，一個5 ' -磷酸基與相鄰堿基上對應的3 ' -羥基共價連接。這發生在兩個互補鏈上，因此鈍端插入可以在兩個方向(即兩個方向)連接到矢量上。鈍端與其他鈍端普遍兼容，因此通過使用具有不同懸垂序列的粘端實現的方向性是不可能的。

那麼，如果您希望得到一個定向克隆的插入呢?在這種情況下，簡單地去磷你的載體是不夠的-這將有助於背景，就像我們上麵提到的，但對方向沒有幫助。幸運的是，有一些技術可以解決這個問題。一種，如Costa和Weiner(1994)所述，利用單磷酸載體和插入物。這裏的策略是隻在雙鏈載體中的一條DNA鏈上創建5 ' -磷酸基，並以這樣一種方式插入，使完整的圓形共價鍵隻可能在一個方向上(見圖4)。

另一項由德爾菲遺傳學開發的技術使用了他們所謂的Staby®係統．在這裏，克隆載體被工程包含一個被截斷的抗毒素基因稱為ccdA。插入物的5 '端包含14個堿基的區域，當克隆到線性化的載體中時，插入物僅向一個方向連接時，ccdA基因被恢複(注意:載體和插入物兩端都有鈍端)。插入的理想方向可以通過連接到ccdA基因的14對堿基對部分的方式來控製。在專門化轉換時，隻有在所需方向上具有插入的克隆才會被選擇大腸杆菌在毒素的選擇性壓力下培養的菌株。插入方向相反的克隆不會產生有功能的ccdA基因，因為它仍然被截斷，而選擇壓力阻止了這些克隆在轉化後的繁殖。此外，重新連接的空載體也將缺乏功能ccdA基因，任何轉化子將在毒素存在的情況下被類似地選擇。

新的克隆技術已經可用，並克服了與鈍端克隆相關的許多挑戰。一定要關注即將發布的Bitesize Bio關於這些的文章。188bet手机版APP

參考文獻

Costa GL和Weiner MP。(1994)鈍端聚合酶鏈反應產生的DNA片段的克隆和分析協議．PCR方法:．3.(5): s95 - 106。Doi: 10.1101 / gr.3.5.s95