如何分離線粒體的DNA:一個精力充沛的指導嗎

為什麼研究線粒體DNA ?

線粒體產生三磷酸腺苷(ATP)的大部分,需要多種細胞過程。這些細胞發電廠有16 kb圓形基因組編碼的蛋白質,[1]和線粒體DNA的突變(mtDNA)與多種疾病相關,包括聽力喪失、肌肉疾病、糖尿病、神經退行性疾病和癌症。(2、3)

序列mtDNA之前研究這些突變的影響在這些和其他障礙,你需要首先隔離它。mtDNA在幾個重要方麵不同於核DNA。確保你的結果是可靠的隔離和測序mtDNA時,您需要理解和考慮這些差異。

mtDNA的特點

數以百計的每個細胞

大多數真核細胞包含成百上千的線粒體,數百份mtDNA(估計2 - 10000每個細胞mtDNA副本)。[4]因此,通常對個人突變隻存在於線粒體的一個子集。因此,並不是所有的線粒體基因組在細胞或生物體是相同的。這是被稱為heteroplasmy。

變異率高

在大多數生物,線粒體是母體遺傳來的,因為這個單性生殖的遺傳重組是有限的。線粒體基因組的變化的其他原因包括缺乏全麵的DNA修複機製[5]和組蛋白,和一個高度氧化環境;所有這些都有助於增加突變率。這heteroplasmy可以識別疾病有關的突變更具挑戰性,因為突變mtDNA之前通常需要達到一個閾值水平的臨床症狀。[6]的技術隔離mtDNA需要保留這個heteroplasmy和允許量化。

Microheteroplasmy

一個有機體可以房子的線粒體基因組數百個獨立突變在1 - 2%的線粒體基因組說。這microheteroplasmy進一步複雜化mtDNA的分析,這些突變沒有量化標準的PCR技術。

核線粒體偽基因的存在

最後,核線粒體(nuMT)偽基因來自線粒體基因的集成核基因組,通常是在非編碼區域。nuMTs的存在是一個混雜因素的識別線粒體基因變異。[7]mtDNA應該有效清除核DNA提取方法來限製nuMTs在下遊的幹擾分析。

盡管高拷貝數,mtDNA貢獻隻有0.2%的總DNA含量的細胞。這個少數民族的地位,隨著觀察heteroplasmy mtDNA,需要豐富的線粒體DNA樣本測序之前在mtDNA檢測突變的能力最大化。

如何豐富的線粒體DNA

有多種方法可用於豐富mtDNA,但是在選擇一個,你應該考慮以下幾點:

• 純潔和濃縮你需要下遊分析水平
• 你有可用的時間花在濃縮過程
• 所需的技能和掌握水平執行方法。

密度梯度離心法分離線粒體DNA

如果你獲得一個超離心機,mtDNA濃縮的黃金標準是通過密度梯度離心法。在這種方法中,總DNA是加載到氯化銫密度梯度離心10小時在450000 x g大小的DNA分離。超速離心法的結果是兩個截然不同的樂隊的DNA;更高的核DNA帶和較低的線粒體DNA的樂隊。溴化乙錠提高密度差,允許更好的可視化DNA和艾滋病的集合,它是通過把一根針插入管在適當的位置和刪除較低的帶豐富的線粒體DNA。

孤立mtDNA,雖然這是一個有效的方法有很多缺點,包括:

• 長時間超速離心法一步
• 危險和有毒化學物質的使用
• 耐心和技巧收集mtDNA樂隊。

同時,產生的力在超速離心法一步和皮下注射針的使用從離心器管中提取的DNA可能導致DNA剪切。

利用線粒體Genome-Specific PCR引物

另一個低成本的方法可用來豐富mtDNA使用mtDNA-specific引物進行PCR。PCR濃縮為mtDNA可以實現通過使用一組引物擴增mtDNA碎片或通過遠程僅使用一個或兩個引物PCR集。(8、9)手冊協議一直在優化,結合傳統miniprep工具包,順bead-based淨化,PCR擴增豐富mtDNA有限。這種方法有一個額外的好處就是:它不需要任何專門的設備,隻訪問PCR機器。

雖然PCR擴增並提供一個有效的和有效的方式為mtDNA豐富,方法受到一些限製。

• 使用的聚合酶可以引入錯誤,很難區分真正的線粒體基因組的突變。
• pcr方法也不適合如果你想詢問線粒體表觀基因組的表觀遺傳標記在放大過程中丟失或改變。

線粒體分離和酶的濃縮

另一種方法是分離和隔離淨化mtDNA之前整個線粒體細胞器。有幾種方法,包括差速離心,它使用幾輪梯度離心分離完整線粒體的細胞溶解產物。另外,一些商用工具為TOM22使用抗體,線粒體外膜蛋白的一個核心組件易位毛孔,綁定到磁珠分離線粒體。[10]

濃縮的mtDNA通過核酸外切酶消化增加上麵這兩個方法明顯的成功。由於線粒體DNA是圓形,核DNA是線性的,一個核酸外切酶消化mtDNA的線性DNA進一步濃縮。[11]

同時結合線粒體隔離和核酸外切酶消化是一個成功的方式為mtDNA豐富,這種方法有以下限製:

• 這是一個耗時的,多步方法
• 使用多個輪離心這可能損害mtDNA導致汙染和核DNA(如果通過差速離心分離線粒體)
• 需要專業設備的形式吸引來捕獲線粒體綁定到珠子(如果使用磁珠捕獲線粒體)。

一個更簡單的方法來豐富的線粒體DNA

的從聖人SageHLS™係統科學提供了一個更直接的和自動的方法mtDNA的濃縮。在此係統中,1 - 1.5全細胞被加載到一個專有的瓊脂糖凝膠盒與裂解緩衝,轉移到樣品的電泳。一旦細胞溶菌作用發生,細胞內容通過瓊脂糖電泳移動。細胞物質,包括蛋白質、RNA,通過瓊脂糖和脂質,迅速行動。核DNA,這仍然是主要的染色體長度,保留在示例,而小mtDNA遷移到凝膠,允許他們的分離。Electro-elution是用於恢複mtDNA準備使用在下遊應用程序如Illumina公司測序^®平台。[12]

濃縮的mtDNA SageHLS提供顯著的好處。

• 簡單的。不需要之前的細胞裂解。
• 快速。濃縮的mtDNA全細胞樣本隻需要不到3小時。
• 非常高效。。不需要離心步驟,核DNA仍是染色體的長度,減少nuMTs樣本。
• 自動化。細胞加載到瓊脂糖凝膠後,提取和大小的選擇是完全自動的,這意味著你可以走開,專注於其他任務。
• 有效的。純度水平與密度梯度離心法,獲得的20倍濃縮mtDNA已被觀察到。[12]
• 溫柔的。DNA是不受長時間或重複離心步驟,意味著DNA剪切最小化。
• 結果。孤立mtDNA可以直接使用在Illumina公司測序平台。

SageHLS可以隔離mtDNA從範圍廣泛的樣本,包括細胞培養組織和禁賽,隻要樣品分散成單個細胞在裝貨前到瓊脂糖凝膠。

mtDNA提取總結

它有利於執行之前濃縮mtDNA測序最小化nuMTs的存在可能產生負麵影響的分析和研究的結果。這種濃縮是可行的通過多種方法,利用核能和mtDNA之間的差異,包括大小、細胞位置和是否線性或圓形。SageHLS方法提供純度和對照的濃縮與密度梯度離心法的在一個簡單,快速和自動方式,不需要超速離心法。

引用

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4. 米勒FJ, Rosenfeldt FL,張C,等。精確測定線粒體DNA拷貝數在人類骨骼和心髒肌肉的pcr分析:缺乏隨著年齡的拷貝數的變化。核酸Res。(2003)31日(11):e61。DOI: 10.1093 / nar / gng060
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12. 無論C &厚德做人N。有針對性的線粒體DNA提取和濃縮使用SageHLS係統。應用注:SageHLS。聖人科學有限公司。2019。