異種核酸:合成生物學和你的研究的基本工具

我們都很熟悉DNA和RNA，這兩種自然存在的核酸儲存著遺傳信息。但你聽說過異種核酸(XNAs)嗎?如果你不熟悉這些合成核酸類似物，不要驚慌!

我們將帶你了解XNAs是什麼，如何將它們應用於生物研究，以及如何開始在實驗中使用它們。

XNAs可用於許多基因工程應用。這些包括擴大遺傳密碼創造適體——合成的寡核苷酸或多肽，專門結合目標分子，如酶。XNAs也比它們的自然對應物更穩定(閱讀下文找出原因)。

XNAs也被用作分子診斷的工具。它們越來越流行於通過合並開發新的診斷分析方法合成生物學方法用於檢測目標核酸序列。

什麼是異種核酸(XNAs)?

盡管XNAs在自然界中沒有發現，但它們與自然存在的核苷酸相似，有一些顯著的區別。

核苷酸由三個主要部分組成:

• 磷酸基;
• 呋喃糖糖;而且
• 含氮堿基。

所有這三個部分都可以通過合並不同的非自然產生的基團來進行合成或改造。

圖1顯示了兩個廣泛使用的XNAs: d5SICS和dNaM，以及它們的自然對應物dATP和dGTP。

因此，XNAs是非標準的DNA和RNA類似物，具有改變的糖環、堿基或主幹，遵守沃森-克裏克配對規則，允許非自然堿基配對。更重要的是，它們仍然能夠存儲和傳遞遺傳信息。

XNAs是如何使用的?

由於它們的多樣性，XNAs在合成生物學、治療學、分子診斷學和生物技術方麵提供了許多新的應用可能性。下麵我們已經討論了其中的一些應用。

1.用XNAs擴展核酸的用途

隨著核酸化學的進步，與天然核酸相比，XNAs的堿基配對穩定性得到了改善，在活組織中的活性也增加了，從而擴大了其在實驗室中的用途，並導致了幾種核酸療法的發展。這裏有幾個例子來說明這是如何實現的。

改變磷酸二酯骨架以增加穩定性

DNA的磷酸二酯骨架可以通過用硼原子或硫原子取代與磷原子單鍵相連的氧原子來修飾。這些產物分別生成硼氧磷酸酯[1]和硫代磷酸酯[2]，由這些XNAs組成的聚合物對核酸酶具有耐藥性，因此增加了它們在治療應用中的穩定性。[3]

用呋喃環代替提高熔點溫度

另一種應用是用不同的糖基取代呋喃糖環(核糖或脫氧核糖)。

的鎖核酸(LNA)就是一個很好的例子，亞甲基與4’碳的共價鍵，以及2’碳的氧(連接它們的額外橋梁)“鎖定”五碳糖環，使其成為確認穩定的lnna - dna和lnna - rna雙鏈。

與DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈相比，這增加了熔解溫度。[4]

將LNAs合並到寡核苷酸引物或探針中可以縮短它們，但仍然允許在更高的溫度下退火。如果使用天然核苷酸，就需要更長的寡核苷酸。

因此，結合LNAs的PCR引物可以在廣泛的條件下提高PCR擴增的靈敏度——LNAs已被證明可以提高實時PCR和DNA測序。[4]

2.擴充基因字母表

也許XNAs最直接的應用是它們在創建擴展的遺傳密碼方麵的效用，這在合成生物學中引起了極大的興趣。用六個核苷酸而不是四個，理論上可以形成216個可能的密碼子。這使得更多的信息儲存在DNA中，因此，擴大的遺傳密碼有可能產生新的生化途徑，在自然界中受到限製。

這是如何實現的?用胸腺嘧啶或胞嘧啶類似物修飾堿基以維持沃森-克裏克氫鍵是一種策略。另一種方法是使用疏水性堿基相互“配對”，模擬成對自然堿基的形狀。[3]

用XNAs合成聚合酶

擴大遺傳密碼的第一步是讓現有的酶將XNAs合並到複製DNA或合成的mRNA中。這對組合形成於XNA被稱為d5SICS和另一個XNA叫dNaM或在d5SICS和一個稱為dMMO2的XNA之間，可以在體外將[6]合並到DNA聚合物中並轉錄在體外使用T7 RNA聚合酶。[7]

下一步是讓活細胞將XNAs合並到DNA、tRNA和mRNA中，並在密碼子中產生一個非自然的堿基對，反過來，該密碼子又編碼an非天然氨基酸．例如，一項研究使用了工程技術大腸杆菌將dNaM和另一種叫做dTPT3 (d5SICS模擬物)的XNA的堿基對合並到複製DNA中。這些XNAs也被轉錄成tRNA和mRNA，並與同源氨基酰基轉移酶，將UAA吡羅賴氨酸合並到修飾的超級文件夾GFP中。[8]

3.Aptamer-based療法

XNAs也有有用的生物技術應用，因為它們可以用來創造比其自然對應物更穩定的新型適體。的在體外篩選方法稱為指數富集配體係統進化(SELEX)可用於從寡核苷酸中創造新的，高親和力的配體。[9]

這些方法已被用於治療活動，但寡核苷酸進入血液後會迅速降解，這並不是一個非常好的治療!然而，你可以使用XNAs進行SELEX，並且結合這些的配體將會更加穩定。

在一項研究中，一種使用含有己糖醇而不是脫氧核糖的XNAs的適體被發現在人類血清中對DNase i具有耐藥性，並與一種稱為血管內皮生長因子(VEGF)的蛋白質結合。考慮到它在腫瘤生長和炎症疾病中的作用，[10]VEGF是一個有趣的靶點，這種基於xna的適體具有治療用途的潛力。

4.分子診斷的創新

XNAs也有作為分子診斷工具的用途。正如前麵提到的，LNAs的雜交熔化溫度比它們的自然核苷酸對應物高，從而使其更短PCR引物或PCR探針。這使得人們可以通過放大較短的DNA片段來獲得足夠的敏感性和特異性。

分子診斷學創新的一個很好的例子是一種檢測基因突變的方法BCL1而且BCL2基因在淋巴瘤。更短的擴增子(即擴增的DNA片段)是以前使用由天然核酸組成的引物和探針的局限性的解決方案。在以前的工作中，需要更長的擴增子來達到臨床級檢測所需的特異性。

LNAs使引物和探針更短，因此，擴增子也更短。如果PCR的目標是富含gc的DNA區域，這種方法尤其有用。[12]

同樣，XNAs異鳥苷(iG)和異胞苷(iC)的配對比天然鳥苷和胞苷具有更高的親和力。這有穩定它們被合並在其中的雙工層的效果。Luminex的MultiCode®-RTx分析技術[14]使用iG和iC實現無探針實時pcr，這是由於iC和iG彼此之間的特殊雜交，而不是與它們的自然存在的對應物。

如何合成DNA

XNAs並入DNA和RNA在體外而且在活的有機體內是可以實現的，但需要一個合適的細胞宿主的工程。[8]

那麼如何開始呢?

如果你不介意在體外靠近，那你就走運了。一種相對簡單的方法是用化學方法合成DNA或RNA聚合物來合並XNAs。

QIAGEN(凱傑)會為你做這件事。他們的LNA Oligo優化工具允許您將您的DNA序列與LNAs輸入到web界麵，並確定融化溫度;你也能看到是否有二級結構或自我補充。通過IDT (Integrated DNA Technologies)技術，可以將iG和iC等XNAs整合到PCR引物和探針中。[15]

另一種方法是生成DNA或RNA片段在體外使用PCR或在體外轉錄．形成氫鍵的XNAs三氮- isog (dP)和硝基吡啶酮(dZ)可以被結合到擴增的DNA中Taq聚合酶。同樣，疏水堿基XNAs dNaM和d5SICS也被處理Taq聚合酶。[16]

dNaM和d5SICS可以被轉錄在體外通過T7 RNA聚合酶。要創建包含這些成分的DNA或RNA片段，隻需將XNA添加到傳統的PCR混合物中，然後讓酶起作用！

下一個在哪裏?

的在活的有機體內使用XNAs的方法是相對較新的，合成生物學是一個快速發展的領域。合成生物學可以使用由XNAs組成的平行生物學來創造合成的生命形式，並通過在遺傳密碼中添加XNAs來增強現有的生命形式。

目前已經有證據表明，我們可以用擴展的基因字母創造新的有機體，但這如何影響新陳代謝、生物化學和合成生命的亞細胞組織仍有待確定。(17、18)

請在下麵的評論區輸入您發現的任何創建XNA聚合物的提示或技巧;我們很樂意收到你的來信!

參考文獻

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14. Luminex公司的MultiCode®-RTx分析技術,訪問8-22-2021
15. 集成DNA技術-改良堿基修飾,訪問8-22-2021
16. 馬克思A和貝茨K. (2020)DNA聚合酶處理非自然堿基對的結構基礎．化學．26: 3446 - 3463。
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18. Budisa N,等．(2020)。外源生物學:平行生命形式之旅．ChemBioChem．21: 1439 - 4227。