什麼是冷凍電子顯微鏡?簡要介紹

冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)和三名對其發展至關重要的科學家被推進到科學主流，獲得了2017年的諾貝爾化學獎。

但什麼是冷凍電子顯微鏡呢?為什麼低溫方麵很重要?它是如何從一無所有到大獲成功的?

簡單的回答是:這是一種在低溫下進行的超高分辨率成像技術，可以提供複雜生物樣本(如病毒)的原子結構。

然而，讓我們再深入一點。繼續閱讀冷凍-電子顯微鏡速成課程。

低溫電子顯微鏡下的亞技術

低溫em有幾個子技術。這些都是:

1. 掃描電子cryomicroscopy(cryo-SEM)。
2. 低溫相關光學和電子顯微鏡(cryo-CLEM)。
3. 冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)。
4. 透射電子cryomicroscopy(cryo-TEM)。

下麵的圖1對比了透射電鏡和掃描電鏡顯微鏡。

技術1-3是相對小眾的，當人們討論低溫電子顯微鏡時，他們總是指4 -透射電子低溫顯微鏡。

所以，這就是本文的重點。

為簡便起見，除非另有說明，冷凍電子顯微鏡及其縮寫均表示冷凍-透射電鏡。

什麼是冷凍電子顯微鏡?

低溫電子顯微鏡是在低溫保存的樣品上進行的透射電子顯微鏡。

低溫使溶液中生物分子的近原子分辨率結構測定成為可能。這包括病毒、細胞器、組織和蛋白質。[1]

低溫是指低於-150°C的溫度。在低溫em中，液態乙烷用於將樣品冷卻到-188°C。

樣品必須保持稀薄。非常薄的．低溫電子顯微鏡的目標是對數十萬個單個粒子進行成像，並將它們組合成定向分類。(持有這個想法。)

因此，由於許多極好的原因，理想的樣品厚度是樣品顆粒的最大尺寸。一個典型的粒子可能有10-100納米的尺寸(100-1000 Å)。

說到樣本，與x射線晶體學不同，低溫電子顯微鏡不需要晶體樣本。這使高分辨率的結構數據收集標本，不可能結晶，包括絲，組織，和一些細胞器。

取消了結晶的要求也使得研究極難結晶的樣品成為可能。例如膜蛋白、大蛋白複合體、核糖體和病毒。

因此，低溫em技術擴大了收集結構數據的材料範圍而且與x射線晶體學平行出現。這最終意味著每個人都有更多的數據。

盡早回答你的問題

我想最後一部分可能已經提出了一些問題。為了以後的清晰起見，讓我們把這些直接清除掉。

為什麼使用液態乙烷?

低溫em的“低溫”方麵提供了三個主要好處:

1. 降低了電子對樣品的輻射損傷。
2. 樣品在顯微鏡中受到保護，使其不受苛刻真空的影響。
3. 水分子被鎖定在原生樣品周圍。

第三點是最關鍵的。雖然低溫電子顯微鏡技術上是一種溶液狀態技術，但它是在冷凍樣本上進行的。

是嗎?

“冷凍”這個詞是一個用詞不當的詞，我們不應該用它來描述冷凍- em樣品。

正確的詞是玻化．低溫電子顯微鏡樣品玻化．

這是說;它們被冷卻得遠遠低於水的冰點溫度，以至於水分子重新排列成冰晶。因為冰晶的密度比水小，而且它們很鋒利，所以它們會在生物樣品形成時破裂並使其變性。所以，盡管低溫em樣品被冷卻到形成固體的程度，這個固體是單個分子在溶液中取向的字麵快照。

(順便說一句，這就是為什麼我們要在感受態細胞中加入甘油。甘油會破壞水分子的氫鍵網絡，以防止形成致命的冰晶。)

液氮有什麼問題?

不是說天氣不夠冷。在-196°C時，它比液態乙烷略冷。事實上，液氮是用來讓液態乙烷保持低溫的!

一個問題在於它的熱容。

熱容量很簡單一種材料能吸收的熱量以產生一定的溫度變化．

液氮的熱容太低，無法成功地將冷凍電鏡樣品玻璃化。一旦落入液氮中，液氮會從溫度高得多的樣本中吸收熱量，從而使部分液氮沸騰。這減慢了冷卻過程，從而形成冰晶，破壞樣本。

液態乙烷比液態氮有更高的熱容量。當樣品被投入其中時，它不會沸騰，所以冷卻過程更快，允許純粹的玻璃化。

另一個問題是液氮在液氮表麵上方形成一層冷氣體的傾向。這可能會導致樣品預冷，因為它被浸入液氮，導致冰的形成。[２]

既然我們已經有點離題了，我們來討論一個推論。曾經凍幹過質粒DNA的讀者可能會想:“等等，水在真空裏不崇高嗎?”

是的,它確實!但大多數冷凍幹燥機的工作溫度在零下60攝氏度左右。如果溫度再低一些，升華的物理動力就可以忽略不計了。這就是為什麼冰衛星可以在真空的太空中存在上億萬年。

記住:升華是指一種物質從固體轉化為氣體而從來沒有變成液體。在移動。

為什麼薄樣品如此重要?

讓我們不要在這裏討論單粒子圖像重建，因為理論和儀器是如此先進，它們接近於魔法。

樣品太厚的原因:

1. 分子在顯微鏡的不同焦高度。
2. 玻璃化水對入射電子的散射。

這兩種方法都降低了信噪比，削弱了魔力。[3]

關於第一點，重要的是要記住，低溫- em結構包括從至少數萬個相同的個體粒子收集的數據。

關於第2點，重要的是要記住，樣品分子散射入射電子，這些電子通過一係列透鏡重新聚焦，從而產生電子顯微圖。被玻璃化的水散射的電子不能編碼關於樣品的有益信息。

低溫電子顯微鏡的尺寸和分辨率限製是什麼?

沒有硬性的限製。

然而，這並不是全部情況。讓我們花點時間來考慮x射線晶體學中的樣品大小和分辨率限製。

• 最大的尺寸限製是任何會結晶的東西。
• 沒有下限，因為小分子比大分子更容易結晶。
• 分辨率極限是輻射波長λ除以2。

也有一些例外，如洗滌劑和聚合物，它們不容易結晶。然而，公平地說，這些都是明確的規則。

但低溫電子顯微鏡卻不是這樣。總而言之:

• 沒有理論上的尺寸上限。
• 目前最低尺寸限製是52 kDa。[4]
• 目前的分辨率上限為1.22 Å。［5］

然而，這些值很可能會隨著本文的老化而改變，因為限製不像x射線晶體學那樣明確。讓我來詳細說明。

在科學文獻中並沒有真正討論過低溫電子顯微鏡的尺寸上限。通常假設樣本容量限製是任何您可以淨化的東西，麻煩地解決，或可以負擔得起計算能力。

因此，它被用於解決登革熱病毒的結構，該病毒重約11 MDa。[6]足夠大。

然而，較低的大小限製是一個熱門話題。在撰寫本文時，使用低溫em解決的最小結構是鏈黴親和素，重52 kDa。[4]細菌蛋白質的平均分子質量為40-50 kDa依種和屬而定。因此，我們很清楚為什麼會有大量的努力來降低這個下限。

順便說一句,預測理論低溫em下限為38 kDa。原因是太複雜了，無法進入，但必須從非晶體材料獲得高質量的信息的困難。如果你喜歡深入研究，你可以在這裏閱讀。[7]

同樣，決議限製也受到若幹複雜因素的影響。這些包括成像過程中樣品的光束誘導運動，玻璃化過程中的樣品損傷，成像過程中的樣品損傷，以及次優曝光時間。迄今為止，使用低溫- em解決的最高分辨率結構是apoferritin，為1.22 Å。［5］

低溫電子顯微鏡與x射線晶體學

讓我們比較和對比高分辨率生物分子成像技術。

我們已經談到了低溫電子顯微鏡和x射線晶體學之間的一些區別。我們還沒有討論的一個區別是，這些技術中的樣本是如何被照亮的，這是基本的。

在低溫- em實驗中，電子在撞擊樣本時被散射。

電子帶負電荷。這種電荷可以利用電磁實時聚焦散射電子來產生圖像(顯微圖)。

我們的眼睛對可見光光子也有類似的反應。雖然這些量子不帶電，但它們的波長足夠長(約400-700納米)，可以與光學透鏡相互作用，並通過光學透鏡聚焦。

200 keV電子的波長約為2.7 pm。這是可見光波長的15萬倍，太小了，無法用光學透鏡聚焦。因此需要電磁鏡片。

x射線是兩個世界中最糟糕的。它們的波長在x射線衍射實驗中約為1 Å，由於太小而無法與光學透鏡相互作用——它們隻能直接穿過光學透鏡。

召回1 nm = 10 Å = 1000 pm。

x射線也不帶電，所以不能用電磁透鏡聚焦。用這種方式來展示樣本真的很糟糕。

因此，在x射線衍射實驗中，晶體樣品散射的x射線必須在數學上集中，並在稍後的時間點上集中。

不幸的是，這會導致關鍵數據丟失。事實上，情況比這更糟。所有對最終電子密度圖貢獻最大的數據都丟失了。哎喲!

這叫做相位問題．這不是無法克服的，但我們永遠無法取回數據。相反，它必須通過一個複雜的過程進行評估，包括有靈感的試錯和其他巧妙的方法。[8]

這導致了它自身的問題，尤其是其中的一個電子密度圖的模型有不可思議的偏向無論是在統計上還是在視覺上都是正確的。

聽起來很可怕，因為事實就是如此!它導致發表的結構後來被發現是完全錯誤的。(9、10)

低溫電子顯微鏡，因為散射電子的重新聚焦是使用物理透鏡實時完成的，不會受到這個問題的影響。沒有相位問題。它確實有自己的偏見，我們會講到這些偏見，但它們沒有那麼有害。

低溫電子顯微鏡與核磁共振

那麼核磁共振呢?我們還沒說過。

它不依賴於輻射來照亮樣品，所以它也不存在相位問題。相反，它測量的是原子核在脈衝磁場中的排列方式。

這很好，因為它需要真正的溶液狀態樣品，而不是晶體或玻璃化的樣品。因此，缺乏細胞內成像，核磁共振樣品是最能代表原生狀態的。

然而，核磁共振譜很快就會有噪聲。來自這數千個原子核的數據不像顯微照片或衍射模式那樣在空間上得到分辨。因此，蛋白質核磁共振波譜是複雜的，很難去卷積。

這意味著，除了高度專業的應用，蛋白質NMR的樣品大小上限約為35 kDa。這顯然排除了大多數蛋白質···蛋白質複合物和任何大型複合物，真的。

這是很多信息。讓我們總結下表1中技術之間的比較。

潛在的問題:冷凍電子顯微鏡的未來

盡管渠道非常有限合適的顯微鏡，比如泰坦克裏奧斯在美國，低溫em技術正在改變分子和結構生物學領域。這從我們在介紹中討論的所有內容和快速瀏覽EMDB．

但有兩件事我們需要解決。

低溫電子顯微鏡的偏誤

早些時候，我讓你們考慮一下對粒子的分類。我還提到了冷凍- em結構存在偏差。這些是要點，因為它們代表了低溫em需要解決的重大問題。

電子顯微照片上的粒子有各種各樣的取向。這些取向必須劃分為不同的類別。然後，每一個被包含在分析中的粒子被分配給一個類。簡單。[12]

這可能會導致偏見。尤其是手動賦值時。但當程序由人類編寫而自動完成時，這種情況也會發生，盡管深度學習算法可能會改善這一點。

由此產生的一個令人擔憂的結果是，研究人員最終可能會得到一個包含以下特征的電子密度圖不在他們的樣品。這樣一來，就很容易得出錯誤的結論。

一種解決方法是隨機地將所有分析過的粒子分成兩組。然後建立兩張電子密度圖，看看它們的比較效果如何。[14]好了!但這隻是提供了一種衡量內部一致性。

估計絕對正確是困難的。還記得x射線晶體學中的相問題嗎?我可能低估了它的價值，但它的問題太大了，它偷偷地推動晶體學家構建不正確的模型，以至於他們想出了一個解決方案。

它被稱為自由R因子。基本上，一組衍射數據(通常5-10%)在構建電子密度圖的過程中被完全省略。它根本沒有被使用。然後，當你建立一個電子密度模型時，你會定期對它進行計算衍射實驗。如果模型是正確的，它應該與衍射數據一致不曾經建造過它。

低溫電子顯微鏡急需同等的度量標準。問題是，要想出一個這樣的方法並不容易。

目前，所有被提名的粒子都需要用來構建電子密度圖。你不能隻把其中的10%扔進垃圾桶。即使你可以從你的原子模型中反向計算一張顯微照片，你又如何解釋所有不同的粒子方向呢?你能有多少信心相信顯微照片如此嘈雜?

好的，你可以從你建議的模型中，反向計算出一個電子密度圖，然後在顯微圖上選擇與它相似的粒子，以此推導出後續的電子密度圖。但是，盡管這可能是出於好意，但它隻會導致更多的偏見。

低溫電子顯微鏡的分辨率過高

還有另一個問題。決議。早些時候，我引用了迄今為止使用低溫em解決的最高分辨率結構，載鐵蛋白，到埃的百分之一。這是一個微微米。我故意這樣做是為了說明這一點:任何解決的結構精確到一皮克嗎?

答案是否定的。這是因為單個分子的實驗結構本身甚至沒有統一的分辨率。特別是在低溫em中，各向異性(非均勻)分辨率是使用它解決的結構的一部分。[16]

問題在於，我們過於依賴分辨率作為判斷結構的最終標準。我一直在增加問題。在這篇介紹中，當比較低溫em和它的同行時，我多次強調了分辨率。我還沒有談到任何其他指標。

需要說明的是，過度依賴所謂的分辨率並不是低溫em技術的出現所造成的問題。事情遠不止如此。雖然，它是公平地說，低溫em是一個革命性的技術在結構生物學的中心階段。因此，這是一個改變舊習慣的機會。

僅僅采用低溫電子顯微鏡就已經是改變科學家行為的一項壯舉，讓我們麵對現實吧，他們可能非常固守自己的方式。另一個一定是可能的。

喊回來!

什麼是冷凍電子顯微鏡?我希望我已經給了你一個理性而又有價值的答案。

雖然我已經涉足低溫電子顯微鏡，但從任何意義上說，我都不是一個顯微鏡專家。不過，我相信你們很多人都是。所以請添加任何相關的東西，或者直接把我放在下麵的評論部分!如果你覺得這個介紹有幫助，也大聲喊出來吧。

參考文獻

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9. Wlodawer A，女兒Z和Porebski PJ等．(2018)檢測、糾正、撤銷:如何管理不正確的結構模型．2月J285: 44466
10. Hodel A, Kim S-H, Brünger AT (1992)大分子晶體結構中的模型偏置．學報A48: 851 - 58
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