CRISPR-Cas13:如何革新你的RNA研究

聚類規則間隔短回文重複序列(CRISPR)相關蛋白(Cas)是原核適應性免疫係統的組成部分，保護它們免受病毒的侵害。Cas9是基因組編輯中最廣為人知、應用最廣泛的Cas蛋白。然而，Cas13蛋白結合和切割RNA的發現為基因組編輯的可能性打開了一扇門。你可以在你的研究中使用Cas13蛋白來敲除、修飾或追蹤哺乳動物細胞中的rna。此外，在Cas13的幫助下，你可以在幾分鍾內檢測到患者樣本中的特定rna。

什麼是Cas13以及它是如何工作的?

Cas13蛋白的發現

CRISPR-Cas蛋白質自然存在於細菌和古菌中。這些蛋白質根據它們的同源性和功能分為第1類和第2類。2015年，第2類蛋白質的新成員被鑒定出來。(1)其中一個被鑒定的蛋白是C2c2 (Class 2 candidate 2)。

C2c2蛋白與其他Cas蛋白的區別在於存在兩個高等真核生物和原核生物核苷酸結合結構域(HEPN)，預計該結構域可賦予該蛋白RNAse活性。其他研究小組此前已經發現了重複相關神秘蛋白(RMAP)模塊(Cmr) Cas複合體，該複合體的蛋白質靶向並裂解古生菌中的外來RNA。(2)但對CRISPR-Cas蛋白C2c2/Cas13a進行表征的是Abudayyeh和他的同事。（3）

Cas13蛋白的功能

在細菌中，Cas13蛋白是一種抑製外來RNA的防禦機製。與Cas9或Cas12不同，Cas13隻結合和切割ssRNA。Cas13在引導rna (gRNA)的幫助下找到它的目標，也被稱為CRISPR-RNA (crRNA)。gRNA由大約70個核苷酸組成的保守序列，其發夾狀結構與Cas13結合，其次是一個由29個核苷酸組成的可變序列，與目標RNA互補。

兩個HEPN結構域提供了Cas13的RNAse活性。這些結構域的突變導致Cas13蛋白失活，即死Cas13 (dCas13)，它可以結合但不能切割RNA。一旦Cas13切斷了它的目標RNA，它就會在細菌中顯示出跨側RNA酶的活性。盡管反式核酸酶活性可以切割任何RNA，獨立於其序列，來自不同細菌種類的Cas13蛋白對特定序列有偏好(圖1)。

子分類的Cas13

Cas13蛋白存在於至少21個細菌基因組中(1)。它們都有兩個HEPN結構域，但全長蛋白的大小取決於它們來自哪種細菌。這就是為什麼它們被細分為Cas13 a, b, c, d等。此外，由於它們所結合的發夾狀結構的序列在不同的物種中是不同的，它們所來自的細菌的學名通常包含在名稱中;例如，LbaCa13a來自Lachnospiracea細菌．圖2顯示了不同Cas13蛋白的比較情況。

自從它的發現和表征以來，這種可編程RNA結合蛋白已經改變了我們沉默基因表達的方式，以及我們研究、修改、跟蹤和檢測RNA的方式。

應用Cas13

使用CRISPR-Cas13敲除RNA

Cas13在真核細胞中的第一個應用是敲除(KD) mrna。但是為什麼要用Cas13來敲除RNA呢?

• 你可以達到90%以上的擊倒效率。當基因敲除對細胞是致命的或當需要暫時的基因抑製時，這為基因沉默提供了一個極好的替代方案。
• 使用Cas13可以獲得比RNA幹擾(RNAi)更好的KD效率。（4）
• Cas13比RNAi有更少的脫靶效應。（4）

最初認為Cas13的非特異性反切活性在真核細胞中不存在。然而，越來越多的證據表明，Cas13脫靶效應的程度取決於使用哪種Cas13蛋白。（5）

PspCas13b的脫靶效應比RfxCas13d少，但脫靶效應的頻率也因靶RNA和細胞係的不同而不同。(5)為了最大限度地減少脫靶效應，必須精心設計針對目標RNA的gRNAs，並在實驗中始終包含陰性對照。

利用dCas13跟蹤和修飾活細胞中的RNA

催化活性Cas13蛋白(dCas13)可以結合RNA，但不能裂解RNA。這一特性為利用Cas13研究和修飾rna提供了另一種途徑。

例如，你可以通過將TRMT6這樣的甲基腺苷轉移酶融合到Cas13中來增加RNA的穩定性和轉譯性。(6)或者，如果將Cas13與熒光蛋白(如GFP或mCherry)融合，細胞內RNA的位置和動態可以通過活細胞成像記錄下來。(7）

使用dCas13研究RNA的最大優點是，基因組不需要編輯添加其他RNA序列(如MS2)來跟蹤它，這使得dCas13比現有的係統更快速、更容易使用。

與使用活動的Cas13時一樣，演示用於dCas13的grna是特定的是很重要的。這可以通過使用含有活性蛋白的dCas13 gRNA並觀察目標RNA的減少(通過RT-qPCR測量)來實現。

疾病診斷和治療

由於其潛在的非靶向效應，Cas13的跨側支活性並不能使其成為敲除RNA的完美工具。然而，它使它成為一個完美的診斷工具，促進了一個在體外診斷工具叫做特異性高靈敏度酶報告解鎖(SHERLOCK)．

《神探夏洛克》允許在給定樣本中檢測特定的RNA(病毒或細胞)。SHERLOCK可以檢測到atomolar (10^-18年摩爾每升)的RNA含量。此外，由於Cas13的特異性，可以檢測到RNA中的單核苷酸突變。這使得檢測攜帶突變的rna成為可能，並開啟了使用Cas13靶向與遺傳疾病或癌症相關的rna的可能性。

去哪裏買Cas13蛋白

不幸的是，目前隻有一個商業來源的Cas13蛋白(McLab)。一些公司可以為你製造和純化細菌中的蛋白質，但成本太高，每個人都無法獲得。然而，最好是從質粒中過度表達蛋白質，以便使用哺乳動物細胞進行研究。Addgene提供了大量不同的質粒。表1顯示了一些最常用的語法。

Cas13總結

從它的發現開始，Cas13就成為了幫助我們了解RNA世界的重要工具。與Cas9相比，它的體積小，這使它成為一種容易處理的蛋白質。它結合和切割RNA的能力使它成為在無法使用Cas9時調節基因表達的絕佳選擇。

dCas13版本提供了一種簡單的方法來修改特定的rna。甚至它的反式核酸酶活性也可用於RNA檢測。我相信這隻是一個開始，未來還會出現更多Cas13的應用程序。

你在研究中使用Cas13嗎?請在下麵的評論中告訴我們。

參考文獻

1. Shmakov年代等．(2015)不同2類CRISPR-Cas係統的發現和功能表征。摩爾細胞。60(3): 385 - 97
2. 黑爾CRet al。(2009)由CRISPR RNA- cas蛋白複合物引導的RNA切割。細胞139(5): 945 - 956
3. Abudayyeh Oet al。(2016)C2c2是一種單組分可編程rna導向rna靶向CRISPR效應器。科學353(6299): aaf5573。
4. Granados-Riveron J等．(2018)精準的癌症轉錄組工程。癌症Res。78(15): 4107 - 1413
5. Ai Y等．（2022）CRISPR/Cas13效應器有不同程度的脫靶效應，限製了它們在真核細胞中的應用。NAR。；gkac159
6. 唐T等．(2021)cas13介導的RNA修飾可編程係統及其生物學和生物醫學應用。前麵。細胞Dev。雜誌。9: 677587
7. 楊家登陸點等．(2019)用CRISPR-Cas13係統動態成像活細胞中的RNA。分子細胞76: 981 - 997