為了分離質粒DNA，你需要打開細胞，進行一個小型準備，盡量避免汙染基因組DNA。對於基因組DNA，你用一種不同的方式打開細胞，試圖分離出盡可能多的內容物。

那麼這些協議有什麼不同呢?

在這篇文章中，我們將看看質粒和基因組DNA提取，以及這些技術的不同之處。

基因組DNA提取:

1.裂解:把它們敲開

基因組DNA提取是更簡單的過程，因為強裂解是釋放gDNA到溶液中的唯一必要步驟。對於酵母、植物和細菌來說，裂解是指在機械破壞質膜之前，先用酶破壞堅硬的細胞壁。

細胞壁通常可被水解細胞壁肽聚糖的溶菌酶和絲氨酸蛋白酶k酶消化。對於某些革蘭氏陽性菌，溶葡萄球菌將進一步幫助酶消化。對於細胞壁組成不同的外來物種，你可能需要使用不同的酶。

機械破壞細胞壁是一種較為通用的提取gDNA的裂解方法。打珠是很受歡迎的，你可以很容易地用0.1毫米的玻璃珠或0.15毫米的石榴石珠在漩渦中打珠。特殊的渦流適配器有助於同時以相同的效率執行多個提取。打珠比酶解更快，通常也更徹底。

對於堅韌的絲狀真菌(例如:曲黴屬真菌和鐮刀菌素(Spp .)，細胞材料通常在液氮中快速冷凍，在杵和臼中研磨，然後在有適當的裂解緩衝液的溶液中快速旋轉。

2.和淨化

在細胞裂解(將gDNA帶入溶液中)之後，唯一要做的就是純化樣品。你可以使用苯酚-氯仿或自旋過濾膜技術，添加胍鹽，促進與二氧化矽的結合。

3.幾句忠告

染色體在純化過程中會斷裂，因為它們太大了，無法保持完整;對於大多數應用程序來說，這不是問題。事實上，對於PCR和qPCR來說，斷裂實際上可能是有利的，因為它有助於DNA融化，從而導致更有效的擴增反應。然而，對於使用大DNA片段的應用(例如。長讀測序和遠程測序)這可能是一個嚴重的問題。如果您確實需要為這些應用程序分離超長DNA片段，則應該考慮另一種設置。

的大腸杆菌染色體的大小剛剛超過4.5 MB，相當於每個細胞約0.005皮克。來自單個起始菌落的典型過夜培養大約包含1-2×10⁹細胞/毫升。從理論上講，這意味著每109個細菌細胞在1毫升的培養液中應該產生約5µg的gDNA。在計算您所選擇的應用程序需要多少DNA時，請考慮到這一點。

質粒DNA提取

質粒DNA提取有點棘手，因為質粒DNA必須與gDNA分開。這種分離是基於粒度的，而良好的分離依賴於使用正確的裂解方法。

1.堿性溶菌作用

對於質粒DNA的提取，裂解必須比簡單地用酶咀嚼細胞壁或用玻璃珠敲打細胞壁要微妙得多。伯恩博伊姆和多利發明了(幾乎)通用的方法質粒DNA提取1979年通過堿性裂解。

裂解緩衝液中含有氫氧化鈉和SDS，可以使質粒和gDNA完全變性(即將DNA分離成單鏈)。這一步必須迅速進行，因為過度變性可能導致質粒發生不可逆變性。

接下來，樣品在醋酸鉀溶液中中和，使質粒變性。這是質粒和gDNA分離的關鍵。因為質粒很小，它們很容易重新退火形成dsDNA。然而，基因組DNA太長，無法完全恢複，相反，它傾向於糾纏在一起，使互補鏈保持分離。

在離心過程中，gDNA(與蛋白質結合)形成顆粒，而質粒DNA保持可溶性。在這一步的關鍵是不要使樣品劇烈旋轉或混合，因為gDNA很容易斷裂，斷裂的gDNA可能足夠小，可以重新退火並與質粒一起進入溶液。

2.淨化

上清液中的質粒DNA可以用乙醇沉澱或用苯酚-氯仿或自旋過濾器清洗。如果使用自旋過濾技術，中和緩衝液將含有胍鹽，因此裂解液可以直接結合二氧化矽進行進一步的洗滌和洗脫。所得的DNA純度足以滿足大多數下遊分子生物學應用。如果需要質粒進行轉染，陰離子交換純化是去除汙染內毒素的較好選擇。內毒素去除也可以使用更快的矽基淨化裝置。

該方法與哺乳動物和其他真核生物質粒以及其他小的染色體外DNA物種兼容。但是，請記住質粒拷貝數在哺乳動物細胞和植物核外細胞器中通常要低得多。

3.還有一些建議

質粒DNA通常為3-5 kb，這取決於插入物的大小。具體的複製的起源Present會影響每個細胞的質粒拷貝數。一個典型的高複製質粒，如pUC或pBluescript，每毫升培養物應產生4-5µg DNA。

為了分離出高產量的質粒DNA，使用晚期對數期或早期固定期培養。用新鮮的單菌落和合適濃度的新鮮抗生素製備培養物以維持質粒。重要的是不要過度培養細菌，因為這可能會導致質粒提取物中的gDNA汙染。

如今，什麼都有工具包，互聯網上有大量關於從質粒、基因組和兩者之間的任何東西中提取DNA的信息!

進一步閱讀:

最大化全血DNA產量。//www.mobtapp.com/30243/maximizing-yield-whole-blood-dna-extraction/

最初出版於2014年，於2019年再版。