故障排除RNA隔離

盡管應用廣泛，分離RNA仍然是比較挑剔的協議之一。幾乎每一個使用過這項技術的人都有自己的技巧和技巧來成功地從他們的樣本中分離出完整的RNA。雖然由於RNA的不穩定性，它在某種程度上是不可預測的，但有一些常見的問題是可以解決的。

1.問題:RNA中的基因組DNA
高分子量塗片證明RNA與基因組DNA洗脫，或在凝膠上顯示幹淨，但進行PCR時-RT控製擴增。

原因:無論你用什麼方法來分離RNA, DNA的痕跡總是會被帶走。TRIzol(苯酚)製劑和二氧化矽自旋過濾器就是如此。這可能是由於在均質過程中基因組DNA剪切不足造成的。如果使用苯酚法，則pH值苯酚的含量是關鍵(它應該是酸性的)，你的移液技術隻會導致或多或少的DNA汙染。

解決方案:基因組DNA需要很好地均質化，所以要使用一種能充分破碎DNA的方法，如高速珠錘或多聚旋翼定子。樣品將在均質過程中加熱，但在胍中冷卻樣品會導致鹽析出。所以你需要平衡均勻化的時間和冷卻到室溫的時間。

去除gDNA的最好方法是用dna酶處理，比如RTS DNase™工具它含有一種高活性、室溫穩定的DNA酶，可以有效地去除汙染的DNA。在去除DNA後，用樹脂去除DNA酶，不需要加熱或EDTA。這種試劑盒特別推薦用於富含gDNA的樣品(即脾髒組織)，在DNase處理前已經純化的樣品，以及需要處理部分樣品的樣品。“柱上”方法也可用於含有低水平gDNA汙染的樣品。

2.問題:降解RNA/低完整性
rRNA條帶是塗在凝膠上的，或者18s條帶比28s條帶更強烈。在安捷倫生物分析儀上，你可以看到一個更大的18s峰。

原因:在加工過程中的某個時刻發生了降解。這一點很難確定。它可能發生在收集和儲存過程中，也可能發生在提取過程中。也可能是隔離後發生的。

解決方案:如果在存儲過程中出現問題，請確保樣品采集後立即冷凍。使用液氮或-80°C儲存。對於動物組織，使用RNALater，然後儲存在-20°C。

如果在提取過程中出現問題，可以嚐試在裂解緩衝液中加入β -巰基乙醇(BME)。每1ml裂解緩衝液中使用10µl 14.3 M BME。BME會殺死rnase，並在提取過程中幫助穩定樣品。

如果從冰箱中取出的樣品沒有保存在防腐劑溶液中，不要讓它解凍。在BME存在的情況下快速均勻化。確保不要留下任何大塊的組織。它需要完全分解。

分離後RNase也會發生降解。確保用於球團洗脫或重懸的水不含RNase。許多試劑盒為RNA工作提供水，通過DEPC處理或以其他方式純化。更多關於DEPC治療和RNases背後的神話可以在這裏閱讀。

此外,10種工作方式RNase免費這篇文章可能對你有幫助。

3.問題:RNA中的抑製劑
RNA的讀數異常低，為260/230(低於1.0)或260/280，或在逆轉錄中不起作用。

原因:RNA準備中較低的260/230表明樣品中攜帶胍鹽或有機抑製劑(如腐殖酸或多糖，如果樣品是環境的)。胍鹽用於TRIzol和二氧化矽製劑。這些鹽使rnase失活，但也會抑製蛋白質，如RT酶，如果存在於最終的RNA。低260/280測量表明蛋白質汙染。

解決方案:對於低至260/230的讀數，最好的方法是嚐試更多的清洗RNA樣本。如果這是TRIzol沉澱，試著用乙醇清洗以脫鹽。對於矽膠準備，用70-80%的乙醇額外清洗幾次就可以清除鹽柱。對於已經純化但不幹淨的樣本，可以嚐試用乙醇沉澱RNA來脫鹽。

對於其他抑製化合物，如腐殖酸和多糖，您可能需要在另一個柱上重新純化樣品，並在洗脫前將其洗好。傳統方法無法將其中一些化合物從RNA(或DNA)中去除，因為它們與核酸過於相似。在這種情況下，您可能需要考慮使用抑製劑除塵技術環境樣品。

蛋白質攜帶較低的260/280讀數很可能是因為試劑盒或方法使用了太多的樣品。樣品淹沒了化學反應，蛋白質沒有被完全去除。試著用另一種方法來清理樣品——要麼是苯酚、氯仿和沉澱物，要麼是加入結合鹽和乙醇，並與另一個二氧化矽自旋過濾器結合。這種蛋白質應該很容易去除。下次盡量少用樣品，確保均質完成。

4.問題:RNA產量低
RNA的產量低於預期——根據你之前的結果，或者根據特定組織或細胞類型的報告產量。不同培養細胞和不同組織的RNA產量差異很大。為血RNA，它可以因人而異。

原因:如果RNA的產量低於你的預期或知道它應該是，而RNA是完整的(閱讀:沒有降解)，那麼均質化可能還沒有完成。為了分離RNA，強裂解是關鍵。儲存在RNALater中的組織會變得更難勻漿。低產量可能是由於組織稱重或培養細胞計數的錯誤造成的。你的細胞可能比你想象的要少。對於血液RNA，根據你收集白細胞層的技能和每個病人的情況，灰白色的外殼可能會有所不同。

解決方案:對於RNA產量低，但RNA完好的情況，專注於均質化方法，並確保從所有細胞中獲得良好的基因組DNA剪切和RNA釋放。如果你在勻漿中看到任何組織或碎片，那就是丟失的RNA。

稱量小塊的組織是很困難的，所以要確保你使用的秤精確到你需要的重量，或者你可能會看到從準備到準備的變化以及純度和堵塞柱時使用太多的其他問題。對於細胞，如果你想要有一致性，有一個準確的計數是很重要的。

如果RNA看起來是降解的，除了產量低之外，問題可能是均質化太困難和樣品加熱太久。試著以30-45秒為一次，同時休息30秒。確保切斷你的組織切片，並迅速將其放入冷胍裂解緩衝液(或TRIzol)中，以防止RNase在建立期間的活動。

使用二氧化矽自旋過濾器，確保柱上的洗脫液有足夠的體積來釋放膜上的RNA。更多的水會洗脫更多的RNA，所以使用最大的體積，讓RNA按照你的需要濃縮。不要嚐試使用低於製造商建議的體積，否則你可能會把RNA留在膜上。若以最大回收率為關鍵，則以多洗多濃縮為宜。

最後……

無論樣本來源如何，RNA的分離遵循類似的協議。對於所有樣品，均質化是第一步，也是最重要的一步。良好的均質化需要快速打破細胞以使裂解緩衝液中的RNases失活，並需要打破基因組DNA的大小以使去除更有效。

2019年6月再版。