酚-氯仿萃取和乙醇沉澱的十大技巧

當涉及到完善你的TRIzol方法技巧時，有許多“有用的建議”需要涉獵，所以讓我們涉獵瘋狂並分享一些技巧!在下麵評論你的經曆、問題和建議!

如果你想看看我嚐試、測試並堅持使用的協議，請查看我的文章:使用TRIZOL®方法提取和溶解蛋白質．康奈爾大學也有一個不錯的文章給你的曆史，誰提出了咒語和魔杖運動的技術。它還會帶你了解其中的化學細節。

這個技巧可能是一個巨大的痛苦，但這裏有一些提示可以幫助你得到最好的結果!

頂級酚-氯仿萃取和乙醇沉澱提示

1.核糖核酸酶走開:

永遠不要讓rna靠近你的樣品或溶液!我喜歡用RNase-zap噴我的工作區域。還要確保你使用的移液管尖端、塑料/玻璃器皿(塑料更好)和水是經過認證的無rnaase的。如果你用凝膠電泳檢測純度，確保瓊脂糖也不含rnase。

2.紙巾就像麵包——新鮮時更好:

盡量使用新鮮的組織樣本。如果不可行，將樣品浸入RNAlater中並保存在-80°C。在你添加TRIzol®之前，確保你移除所有的RNAlater試劑!

3.使用的力:

當協議要求旋轉時，這不是帶著愛和關心反轉你的樣本的時候。你需要完全確定你的混合物就是混合物，否則你以後的分離結果會很差。

4.了解你的均質器:

在我工作的一個實驗室裏，我們有一個非常善變的均質器。如果你使用它的時間超過小間隔，它就會過熱，而較高的設置會讓你全身都是紙巾碎片。均質器很貴，所以不要指望有最新的版本，它可能是一個老舊的，但有一些個性怪癖的好東西。所以，在你被迫學習艱難的方法之前，你應該練習使用你實驗室的均質器。

5.緊貼階段:

如果你的相不能很好地分離，可能有兩種情況，要麼你忘了加氯仿要麼你跳過了第三步。如果沒有這些，混合物中可能會出現不受歡迎的客人，要麼是因為氯仿中有添加劑甚至汙染物，要麼是因為你在過程中添加了強緩衝劑、堿性試劑或有機溶劑。如果你用的是組織，你的樣本可能還沒有充分的均質。如果你處理的是細胞，在加入TRIzol之前可以嚐試用PBS衝洗細胞。

這一點仍然可以(在一定程度上)挽回。向試管中加入等量的(無rnase)水和氯仿，旋渦，再次離心。隻要記住，你的RNA完整性數(RIN)可能很低。

6.不要過度幹燥你的顆粒:

如果你的顆粒很硬，你可以非常輕柔地把試管倒在紙巾上，輕敲試管，以促進乙醇的去除，然後通過平衡試管上下顛倒，讓剩餘的乙醇在室溫下蒸發。如果你擔心藥片太軟或者看不見，不要輕拍試管，隻要滾動紙巾的邊緣就可以了。6分鍾足夠讓小球變幹。如果你擔心組織上的RNAases，你可以噴一些rnaase -zap。

7.快速岡薩雷斯:

速度是人們不總是記得的一個關鍵因素。當你第一次學習這個技巧時，你會慢一些。你每多花一分鍾，你的樣品就會失去完整性。如果一開始你的收益很低，對自己要有耐心。專注於獲得純淨的產品(通過NanoDrop分光光度法或凝膠電泳測試)。如果已經有了幾個回合，你仍然有產量或純度的問題，那麼你應該從一個更有經驗的實驗室成員的幫助!這就是他們存在的意義——我們都是一條船上的人。

8.在罩:

在通風櫃裏工作總是最好的(不要在層流罩裏工作——看這個文章用乙醇和RNase去除溶液徹底噴灑和擦拭。最好不要讓煙霧進入實驗室的其他地方(你的實驗室同事會感謝你沒有讓它有氣味!)

9.溫度問題:

整個過程需要相當多的時間，有時你需要快速得到結果!你可以讓乙醇在-80℃下沉澱30分鍾，得到的收率幾乎和一夜的沉澱步驟一樣多。

10.說出來!

和大多數技術一樣，這種方法可能很繁瑣，而且您的特定細胞係或組織類型可能需要對協議進行一些調整。與實驗室中任何對你的工作有經驗的人交談，去你最喜歡的搜索引擎，看看其他人在網上說了什麼，並查看PubMed上的修改協議的論文。很有可能你不是第一個用你的細胞或組織工作的人，你遇到的任何問題對你來說都不是新的或獨特的。

最好的運氣!