提高全血DNA分離產量的八個技巧

當您執行基因組DNA提取對於全血來說，低產量或低質量的DNA會導致很多問題。無論你的下遊應用是qpcr、下一代測序、Sanger測序等等，你都需要高質量的DNA。我們已經製定了這一步一步的指南，以幫助您獲得最高的DNA產量和質量，並使您走上正軌，以獲得一些偉大的結果。

選擇(或知道)最好的樣品儲存條件

抗凝劑

抗凝血劑有多種選擇。從DNA產率和質量角度來看，EDTA是最佳選擇，其次是檸檬酸鈉。

肝素應避免，如果在所有可能，因為它幹擾您的DNA最終產品的純度。這是因為在純化過程中很難將其從DNA樣本中去除，而且它會抑製下遊的PCR分析。另一方麵，EDTA在標準純化過程中很容易去除。

有證據表明，EDTA比檸檬酸鈉更適合作為更好的抗凝劑，這一證據來自一篇有趣的論文，該論文跟蹤了樣品在室溫(RT)下分別用EDTA、檸檬酸鈉和肝素保存後，DNA提取率的影響。¹

RT保存12 h後，DNA產率有明顯差異。edta存儲的樣品DNA產量不受影響，而檸檬酸鈉或肝素存儲的樣品DNA產量大大降低。

雖然我們不建議你將樣本儲存在RT，但這項研究表明，EDTA為DNA樣本增加了一層額外的保護。這種額外的保護使EDTA優先於檸檬酸鈉。

光照和溫度

應盡量減少將您的樣本暴露在陽光和/或4ºC以上的溫度下，以保存樣本中的DNA。紫外線傷害DNA通過在DNA中形成胸腺嘧啶二聚體。隨著溫度的升高，氧化和酸水解等破壞DNA的化學反應也在增加。

所以，冷藏或冷凍樣本的速度越快越好。

如果樣品將在三天內使用，在樣品提取後盡快將其冷藏在4ºC。一項研究報告稱，當從采血到冷藏的時間縮短時，DNA產量顯著增加。²

如果3天內沒有處理完，則冷凍保存在-80℃。根據Caboux et al 2012，理想情況下，這應該在樣品提取後的兩個小時內進行，以避免對提取基因組DNA的產量產生任何影響。²

溶血

最後，一旦樣本安全地在你手中並被妥善保存，避免溶解樣品中的紅細胞(溶血))．你可以避免溶血隻有在必要的時候混合你的血液樣本，然後通過溫和的倒置。一項研究觀察了5萬多個DNA樣本，發現溶血程度和DNA產量之間呈負相關。²

所以，溫柔對待你的樣品!

細胞計數

檢查正在處理的樣品的細胞計數是最好的做法，可以用血細胞計或自動細胞計數器手工進行。

當然，開始時細胞太少會導致產量低。但是使用更多的細胞隻能在一定程度上起作用。如果一開始使用的細胞數量超過所使用的化學試劑所能處理的數量，將導致產量較低，並增加不完全裂解的可能性，以及蛋白質和其他汙染物的攜帶，這將幹擾下遊應用。

查看您選擇的DNA分離方法的手冊，以確定最佳的細胞數，或通過稀釋係列確定經驗的理想濃度。

如果你發現你的細胞數太高，把樣本分成兩份，分別進行兩次提取。

選擇最佳全血基因組DNA提取方法

有了適當的存儲和相關的樣本信息在手，下一步是確定使用哪種提取協議來獲得最佳的DNA產量。

最常見的選項是phenol-chloroform提取、磁珠分離和化學沉澱(或“鹽析”)。獲得最高DNA產量和純度的方法是沉澱化學法。

• 苯酚和氯仿是這些方法中最古老的一種，但使用了刺激性的化學物質，需要非常小心地處理。除了安全問題之外，任何被帶到萃取終點的苯酚或氯仿都會對下遊的應用產生負麵影響。²因此，就像肝素一樣，這種DNA分離的方法應該盡可能避免。

• 利用磁珠提取DNA是一種毒性較低的方法，但珠子有可能被帶過導致汙染和抑製下遊過程。同樣，像苯酚-氯仿法一樣，如果可能的話，你希望避免這種方法，因為攜帶的珠子會影響你將其用於PCR和其他下遊應用的能力。

• 降水化學“鹽析”是一種流行的DNA提取方法，因為它幾乎沒有汙染，而且產量穩定。有多種工具包可用於這種方法。的Puregene方法按順序溶解紅細胞和白細胞，用RNase處理溶解的樣品，然後沉澱蛋白質和其他汙染物。相比之下，更新的FlexiGene方法在一個步驟中溶解整個血液樣本，並立即通過收集白細胞核球去除RNA汙染，然後與含蛋白酶和潮鹽的緩衝液孵育，去除剩餘的汙染物。在這兩種方法中，DNA都是通過酒精沉澱恢複的。

提高血液樣本DNA產量的其他頂級技巧

從血液樣本中增加DNA產量的最大機會在於樣本的存儲和處理。不過，這裏有一些額外的小貼士可以幫助你提高產量:

• 考慮自動化。不僅是自動化的DNA提取使每個樣本之間的全血更加一致，也消除了人為的錯誤。^{2 - 4}自動提取DNA也會節省你的時間，尤其是當你有大量的樣本需要處理的時候。你可以設置自動化係統，然後回到高質量，純DNA。

• 照顧你的酶．這可能是一個新手的建議，但有時這是最好的。為了防止蛋白酶因過度的凍融循環而降解，應使用含酶緩衝液的等分物。如果這個方法不起作用，第一步可以考慮重新嚐試一種新的酶組合。

• 小心你的DNA顆粒。大多數DNA提取程序在酒精沉澱後以顆粒幹燥步驟結束。這一步可以去除多餘的酒精，但要注意不要過量。如果重懸DNA有困難，嚐試用相應的複水緩衝液在55ºC加熱DNA球約5分鍾。

總而言之，從全血中提取DNA並不複雜，但可能會有很大的出錯空間，從而對最終產品的產量和純度產生負麵影響。這些提示將幫助您導航的過程，以避免大多數陷阱，並給您高產量無汙染的DNA。

參考文獻

1. 林燕玲，譚瑞兒，趙仁偉，盧彥明。(2004)對於延遲血液處理的血漿DNA分析，EDTA是一種優於肝素或檸檬酸鹽的抗凝劑。中國化學。50(1): 256 - 7。(回)

2. Caboux E, Lallemand C, Ferro G, Hémon B, Mendy M, Biessy C，等人(2012)從血液樣本中提取的DNA產量的分析前變化來源:EPIC中50,000個DNA樣本的分析。《公共科學圖書館•綜合》．7 (7): e39821。(回)

3. Montpetit SA, Fitch IT, O’donnell PT.(2005)一種用於法醫案件中DNA提取的簡易自動化儀器。J法醫科學．(3): 555 - 63。(回)

4. 黃DJ, Zimmermann BG, Holzgreve W, Hahn S.(2005)使用自動化方法可以提高從母體血漿中提取的無細胞胎兒DNA的產量和質量。中國化學．51(12): 2419 - 20。(回)

5. Psifidi A, Dovas CI, Bramis G, Lazou T, Russel CL, Arsenos G，等人(2015)適用於大規模全基因組基因分型和長期血液DNA銀行的11種基因組DNA提取方法的比較。《公共科學圖書館•綜合》．10 (1): e0115960。(回)