苯酚-氯仿萃取的實際應用

雖然有更多的方法可供選擇清除你的RNA或DNA比起以前，有時苯酚-氯仿萃取仍然是最好的方法。

在這裏，我將討論使用這種技術的一些實際方麵。

苯酚-氯仿萃取工作原理的(非常)簡要指南

我們之前關於苯酚提取DNA是如何工作的接觸了一些關於有機提取將如何從水溶液中去除蛋白質的想法。

簡而言之，蛋白質由親水和疏水殘基組成，通過蛋白質折疊，與水達成妥協，以保持可溶性。

然而，當它們有機會過渡到一個既能容納極性殘留物也能容納非極性殘留物(即苯酚或苯酚-氯仿)而不需要妥協(即折疊)的環境時，它們會很高興地過渡到那個階段。

極性較強的分子，如碳水化合物和核酸，在水相中“更快樂”(下麵提到一些例外)，並保持在那裏。現在來看看真相。

苯酚與苯酚-氯仿與氯仿

我在培訓某人時，最常被問到的問題之一是，在苯酚-氯仿萃取過程中使用的不同有機相之間有什麼區別。以下是我所了解的詳細情況。

苯酚

我們現在討論的是緩衝飽和苯酚，它的溶液中含有72%的苯酚，28%的水。

由於苯酚是一種弱酸，我們使用的溶液已經用緩衝液平衡了pH值，使其達到特定的目標——酸性的用於RNA純化，微堿性的用於DNA純化。

除了有一定量的水溶於苯酚外，還有一定量的苯酚在平衡狀態下溶於水，水相中會含有7%左右的苯酚。

這被認為有助於提取，因為這種溶解的苯酚有助於使仍在水溶液中的蛋白質變性。緩衝飽和苯酚的密度僅略高於水的密度。

Phenol-Chloroform

這是一種緩衝飽和苯酚和氯仿的混合物，通常接近1:1的比例用於DNA純化，有時用於RNA純化。異戊醇有時也用作消泡劑，但一般認為它是一種惰性的可選添加劑。

這種解決方案是常用的代替有幾個原因。如前所述，苯酚飽和緩衝液的密度隻比水高一點。所以如果你的水相含有足夠的鹽或其他溶質會增加它的密度，那麼你可能會在萃取過程中發生相轉化，你的水相在苯酚下麵，而不是在苯酚上麵。

氯仿的密度比水大得多，所以將氯仿加入有機相中會增加有機相的總體密度，有助於防止相轉化。

此外，氯仿(還有一些人說的異戊醇)有助於減少中間相——兩相之間的模糊邊界，由無法決定它們要去哪裏的分子組成。

這些可以是部分變性的蛋白質，DNA(取決於pH值)，和/或部分變性的DNA結合蛋白質仍然附著在DNA上，這是一個真正的痛苦的臀部。

如果在去除水相時用移液管移去一些這種物質，那麼就會降低樣品的純度。如果你在吸液時太膽小，那麼你就會損害你的產量。

如果你的運氣和我一樣好，那你最想留下的東西就在裏麵。在混合物中加入氯仿有助於減少這種情況。(但對於這個問題，我有一個更好的解決方案，我將在下麵告訴你。)

氯仿

通常在苯酚或苯酚-氯仿萃取後使用。雖然純氯仿在提取蛋白質方麵不如上麵提到的有機溶液效果好，但它在從水溶液中提取苯酚方麵效果很好。

還記得我說過平衡後水相中含有~7%的苯酚嗎?你們還記得我說過苯酚會使蛋白質變性嗎?如果你不去除(或至少嚴重減少)你現在的無蛋白質核酸溶液中的苯酚，它可能會通過部分或完全抑製你處理DNA或RNA的酶來困擾你。

然而，如果有一個漂亮的氯仿巢穴，苯酚就會從你的核酸中分離出來。氯仿本身在水中的溶解性比苯酚(~0.8%)約低10倍，對蛋白質的變性也較低。我很久以前也被告知，它比苯酚更不可能在過程中成球DNA乙醇沉澱很久以前，但我找不到能證明這一點的參考資料。

醚

這也可以用來從水相中提取苯酚。然而，由於乙醚的爆炸性和生物類型在實驗室中傾向於使用本生燃燒器和電擊器，乙醚在很大程度上已被氯仿取代。

不是那麼漂亮的粉紅色

注意:如果溶液變成粉紅色，不要使用苯酚或苯酚氯仿。

苯酚的氧化會產生粉色/棕色的氧化產物，這會導致你的DNA斷裂和RNA降解。

大多數商業苯酚溶液都含有一種抗氧化劑來抑製這種氧化，在酸性pH值下緩衝的苯酚似乎能抵抗氧化，但在你開始提取之前，將緩衝飽和苯酚的一部分(從它可能進入的棕色瓶子中)移到一個透明的瓶子或管道中檢查一下也不是一個壞主意。

pH值重要很多

偶爾有人會進行苯酚-氯仿提取但樣本中沒有任何DNA。如果這種情況發生在你身上，或者你實驗室裏的某人身上，你的第一個問題應該是“你用的是哪種苯酚?”

同時進行DNA和RNA研究的實驗室很可能兩者都有酸性而且基本緩衝苯酚溶液，或者有人買了一瓶新的苯酚卻不注意pH值。

用酸性苯酚提取含有DNA的樣品會導致DNA的變性，一旦變性，DNA就會分裂到有機相。這是許多RNA純化方案的一個關鍵特征，這也是使用酸性緩衝飽和苯酚的原因之一。

更詳細的解釋，請閱讀我們的文章酸苯酚氯仿提取DNA, RNA和蛋白質:3:1．

測定苯酚的pH值

現在，有時實驗室的DNA苯酚提取開始失敗(之後無法恢複DNA)，苯酚的pH值就會受到質疑。如果你發現自己在這個地方，你不能簡單地把pH計浸入其中，你也不能使用pH紙，因為紙上的pH指示劑是在水溶液中表征的。

我使用的方法是用9ml 45%的甲醇稀釋1ml飽和苯酚緩衝液，混合，然後用標準pH計測量pH值。

調節苯酚的pH值

最安全的調整方法pH值方法是用新鮮的100mm緩衝水(DNA工作時通常為Tris pH 7.9)替換苯酚溶液上的水相，將兩相充分混合，然後讓瓶子沉澱，直到兩相再次完全分離。然後再給它加pH。

混合你的階段

苯酚-氯仿萃取的效率驚人——在第一次萃取達到平衡後，平均隻有不到1%的蛋白質殘留在水相中。當然，關鍵是要使萃取達到平衡。

兩相之間的表麵積越大，這一過程發生的越快，表麵積越大，形成的乳液就越細。這可以通過將階段進行幾分鍾的渦旋來實現，這是許多協議所要求的，但並不是所有的樣本都可以渦旋。

如果你純化的是非常大的DNA，比如基因組DNA，那麼你可能需要更溫和地混合樣本，因此每次提取的時間更長。所以在這一點上，遵循您的協議，並非常謹慎地嚐試節省這一步的時間。

變性和消化的影響

一些方案要求在苯酚-氯仿提取前進行蛋白質變性和蛋白酶K消化。這兩個步驟都試圖減少被困在間期的物質的數量，從而提高回收的DNA或RNA的產量。

我從未見過在提取前用SDS使蛋白質變性的任何負麵影響。另一方麵，蛋白質的消化會降低你恢複的核酸的純度。

雖然整個蛋白質幾乎肯定會被劃分到有機階段，但一旦蛋白質被消化成小肽，並不是所有的小肽都具有整個蛋白質相同的化學“特征”，而且每個肽都有自己的劃分號。

如果你的核酸中有一些肽，這可能不是很重要，這取決於你的下遊應用，但這些汙染物可能會影響你未來對樣本的定量。然而，我發現了一個更好的方法來消除可怕的間期。

鎖相凝膠™

這是一種似乎在50%的實驗室中都存在的東西，但隻有不到10%的人知道它是什麼或者它是如何工作的。

我在研究的關鍵時刻發現了這一點，它拯救了我的論文。

簡而言之，相鎖凝膠是一種粘稠的、類似凡士林的凝膠，其密度略大於水。如果你把提取液放在離心管中，然後離心，相鎖凝膠就會在水相和有機相之間聚集，將兩者分開，防止在苯酚-氯仿提取過程中形成急需DNA/RNA的間相。

我在網上搜索了一下，沒有找到任何我認為足夠好的這個過程的圖片，所以我拍了一些我自己的(圖1)。在這個小小的演示中，紅色染料取代了我們寶貴的核酸，藍色染料取代了蛋白質。

圖1:在苯酚-氯仿萃取過程中使用相鎖凝膠™。(A) Phase Lock凝膠®顆粒化到1.5 ml Eppendorf管的底部。(B)加入苯酚-氯仿和水相後，在水相中完成人造DNA(紅色)和人造蛋白質(藍色)。(C)輕輕搖動5分鍾後。離心後(D)。注意，現在凝膠將有機相與水相分離。(E)再次加入苯酚-氯仿，輕輕搖晃5分鍾。(F)第二次離心後。人造DNA現在可以用氯仿提取(如果空間允許，在同一個試管中)，以去除殘留的苯酚。

正如你所看到的，凝膠在兩相之間形成了穩定的分隔，如果你想要第二次提取樣品，而試管中還有空間，那麼你可以這樣做，使用同一試管兩次或更多次，而不影響樣品的純度。

你不能在含有這種試劑的試管中渦旋混合兩相，但你可以在另一個試管中渦旋混合，然後用凝膠和離心機將樣品加入試管中。他們有兩種不同口味的凝膠(請不要吃!)——一種用於普通樣品(輕)，另一種用於高密度樣品，比如高鹽或高蛋白質濃度的溶液(重)。

在提取之前，使用SDS使我的樣品中的蛋白質變性，然後使用Phase Lock Gel™分離相，使我的DNA樣品始終保持260/280的比例為1.8，回收率大於98%。嚴肅偉大的東西。

真空潤滑脂作為相鎖凝膠™的替代品?

感謝羅伯托·羅薩蒂(Roberto Rosati)發現了一篇論文，表明矽樹脂潤滑劑(又名真空潤滑脂)已成功用於幫助恢複核酸。

添加這種潤滑脂(無毒且可高壓滅菌)後，可以形成緊密的間相，使水相完全回收。(1）

我們甚至有一個熱情的Bitesize Bio閱讀器在他們188bet手机版APP的苯酚-氯仿萃取過程中測試這個方法——讀他的報告真空潤滑脂是如何成功的DIY相分離凝膠．

在準備這篇文章時，我偶然發現這個網站，裏麵有很多有用的信息。如果你想了解更多關於苯酚的知識，請訪問它。

注意事項

人們很容易變得自滿我們在實驗室裏用的化學藥品，尤其是當我們經常使用它們的時候。苯酚是一種特別令人討厭的化學物質，它既有毒性又有腐蝕性。

確保你使用適當的個人防護用品,包括合適的實驗室手套戴上安全眼鏡，知道萬一發生泄漏或事故該怎麼做。

現在聽聽你的意見:你有什麼完美的苯酚-氯仿萃取的技巧和提示?

最初發布於2010年5月3日。2021年10月審查和更新。

參考文獻

1.Mukhopadhyay T, Roth JA。(1993)有機矽潤滑劑可提高苯酚-氯仿萃取後的核酸回收率．核酸Res．21(3): 781 - 782。