苄基異戊醇:一種新奇、奇異和有效的DNA純化工具

DNA純化

我們都用我們最喜歡的技術來克隆DNA，比如吉布森組裝，威尼斯平底漁船克隆，非結紮克隆,助教克隆．然而，自90年代以來，DNA純化方法本身並沒有發生太大變化。曆史上，引入苯酚萃取1956年，從大鼠肝髒中純化核酸的技術迅速取代了以前的技術。¹直到1987年，RNA純化方法不斷被改進，硫氰酸胍-苯酚-氯仿成為接下來20年的標準。^2、3大約三年後，發現核酸粘附在二氧化矽粒子上存在朝性化合物，開啟了現在無處不在的時代DNA / RNA miniprep列．⁴從那以後，除非你使用一種更晦澀的技術，比如凝膠內結紮，否則你很可能用一套狹窄的工具來進行DNA純化。

你如何(否則)從核酸溶液中提取酶、清潔劑等?

滿足BIA

BIA (Benzyl:我soamyl一個醇)，是苯酚更溫順的姐妹，是一種去除血液樣本中PCR抑製劑的有機萃取劑。⁵你可以用它與rna酶抑製劑異戊醇以9:1的體積比結合來分離DNA。然後使用像苯酚和氯仿一樣的組合來提取你的DNA。正式的協議應該是這樣的(我指的是“類似的東西”這就是我用的)：

1.將150 ul TE加入到50 ul DNA溶液中進行純化(通常是消化)。
2.加入20 ul 9:1 (v/v)苯甲醇/異戊醇。然後漩渦直到乳化。
3.以最大速度旋轉3分鍾。從離心機中取出後，有機層可能變得渾濁。這似乎沒有任何效果。
4.除去上清液，乙醇沉澱樣品。

異戊醇，當它不阻止RNAse活性和防止苯酚:氯仿混合物中起泡時，(顯然)是一種極強大的蛋白質沉澱劑。在這種情況下，你把它與密度更大的溶劑混合，讓它在離心時顆粒到管的底部。我用濃縮牛血清白蛋白溶液測試過這個技術，發現沒有檢測到蛋白留在水層中。

作為獎勵，BIA似乎完全提取像Triton-X100這樣的清潔劑。此外，BIA的密度並不比水大，因為苄醇的密度約為1.04毫克/厘米^3.．加入異戊醇可能會改變一些情況，但蛋白質球(大部分)在管的底部，跳過了水-有機界麵。殘留在水層中的少量溶劑很容易在後續的乙醇洗滌中去除。而且剩下的那一小部分似乎也不能抑製DNA連接酶。

結果

我的克隆還沒有失敗過，隻要我的DNA濃度足夠高，盡管你的情況可能有所不同。兩名大學二年級學生使用該協議克隆了四種結構，成功率為100%。我把它用於簡單的消化/結紮/轉化方法，還沒有嚐試過其他任何技術。

問題

該協議僅被用於準備用於載體克隆的DNA。建議謹慎，如果你用它來準備你的RNA，你的RT-PCR需要穿越森林，因為你的博士學位的錢是不會退還的。BIA首先是一種蛋白質沉澱劑和一種洗滌萃取劑。注意，蛋白質顆粒可能沒有完全變性，不小心將其重新懸浮在水相中，可能會使僵屍化的EcoRI返回到樣品中。這同樣適用於組織提取，因為BIA似乎不是一個強朝性劑。因此，蛋白質可能沒有完全變性。

如果溶液中鹽含量高，BIA的疏水液滴可能不會成球。這是因為BIA和水的密度相似。BIA也不會從高朝變性溶液(如硫氰酸胍)中析出汙染物。

注意，這個協議不是超級優化，所以發表任何修改，為偉大的DNA和RNA純化。

參考文獻

1.Kirby K.S.(1956)。一種從哺乳動物組織中分離核糖核酸的新方法。物化學。J．64年,405 - 408。
2.喬姆欽斯基和薩基(1987)。酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取RNA的一步法分離．肛交。物化學．162年,156 - 159。
3.喬姆欽斯基，P.和薩基，N.(2006)。硫酸硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取RNA的單步分離方法:20多年來．Nat。Protoc．1, 581 - 585。
4.Boom, R.， Sol, c.j.， Salimans, m.m.， Jansen, c.l.， Wertheim-van Dillen, p.m.， van der Noordaa, J.(1990)。一種快速簡便的核酸純化方法．j .中國。Microbiol．28日,495 - 503。
5.弗雷德裏克，d.n.和雷爾曼，D.A.(1998)。去除聚合酶鏈反應抑製劑聚乙磺酸鈉改進血液培養微生物DNA擴增。j .中國。Microbiol。36歲,2810 - 2816。