DNA提取試劑盒在實驗室是如何工作的

不明白DNA提取套件如何工作？我們涵蓋了本文的基礎知識，因此您可以完善您的核酸分離並獲得高質量的DNA。

我們提供了很多疑難解答的幫助核糖核酸和脫氧核糖核酸因為幾乎我們在分子生物學中做的每件事，188bet手机版APP在第一步都需要DNA或RNA，無論是qPCR，分子克隆，下一代測序，或其他東西。

如今，大多數實驗室都使用使用二氧化矽自旋過濾方法來獲得高質量DNA的商業DNA提取試劑盒。這些允許快速高效純化的DNA(或RNA)。但這確實意味著很多人隻是按照說明去做，並不理解DNA提取試劑盒是如何工作的。

為什麼你應該知道核酸提取試劑盒是如何工作的?

旋轉柱含有二氧化矽樹脂，其選擇性地結合DNA和RNA，這取決於鹽條件和受萃取方法影響的其他因素。

這些DNA提取試劑盒使整個過程比以前的DNA提取方法更簡單、更快。

然而，使用套件的缺點是，如果您不明白套件的黑匣子中是什麼，它會使故障排除更加困難。

因此，在這篇文章中，我將詳細解釋DNA提取試劑盒是如何工作的，以及每一步都發生了什麼。

我還將介紹一些特定於在DNA提取中使用矽膠柱的常見問題，這些問題可以通過一些額外的理解來克服或避免。

RNA和DNA提取的第一步:裂解

裂解公式可以基於是否要提取DNA或RNA，但是常見的母細胞分子是含有高濃度的絡脫鹽的裂解緩衝液。

介紹雜交

朝變性使氫鍵、範德華力和疏水相互作用不穩定。蛋白質不穩定，包括核酸酶，核酸與水的結合被破壞，為轉移到二氧化矽創造了條件。

朝向鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。

別忘了洗滌劑

除朝變性外，裂解緩衝液中通常還含有一些洗滌劑，以幫助蛋白質的溶解和裂解。

添加一些酶

根據樣品的類型，也可以有用於裂解的酶。蛋白酶K就是其中之一，它在這些變性緩衝液中工作得很好;蛋白質的變性程度越高，蛋白酶K的作用就越好。

然而，溶菌酶在變性中不起作用，因此在加入變性鹽之前通常進行溶菌酶處理。

關於質粒製備的說明

關於分離質粒DNA的一個注釋：裂解與RNA的萃取非常不同或基因組DNA提取因為必須首先與基因組DNA分離質粒。

如果你用的是超變性，你會立刻釋放所有的東西，並且不能區別地將小的環狀DNA從高分子量染色體中分離出來。

因此，在質粒製備中，在裂解後未加入雜交，並且鹽用於結合。

一個優秀的深入文章堿性裂解在這裏還有另一篇文章基因組DNA和質粒DNA的區別可進一步閱讀。

DNA提取之後是純化:將DNA與色譜柱結合

椎間相鹽對裂解至關重要，但也適用於將DNA（或RNA）結合到柱中。另外，為了增強和影響核酸與二氧化矽的結合，還加入醇。

大多數情況下這是乙醇但有時也可能是異丙醇。乙醇的百分比和體積有很大的影響。太多的話，你會帶來很多退化的核酸和小的物種，它們會影響A260讀數，影響你的產量。太少的話，就很難把膜上的鹽全部洗掉。

這裏的重要點是乙醇影響結合，添加的量為您使用的任何套件進行了優化。修改該步驟可以幫助更改您恢複的內容如果您遇到RNA或DNA恢複的問題並希望排除故障，這可以是進一步評估的步驟。

另一種診斷問題的方法是將結合後的流出物保存下來，進行沉澱，看看是否能找到你要找的核酸。

如果你在溶解時使用含有sds的洗滌劑，試著使用氯化鈉作為沉澱劑避免用洗滌劑汙染DNA或RNA。

洗滌DNA（或RNA）

裂解液通過矽膠膜離心，現在提取的DNA或RNA應該與柱結合，雜質，細胞蛋白質和多糖應該已經通過。

但是，膜仍然被殘留的細胞蛋白質和鹽弄髒了。如果樣本來自植物，可能還會有多糖，可能會在膜上留下一些色素，或者如果樣本是血液，膜可能會被染成棕色或黃色。

這些洗滌步驟可以去除這些雜質。

通常有兩次洗滌，盡管這可以根據樣品類型的不同而不同。第一次清洗往往會有少量的潮變性鹽，以去除蛋白質和有色汙染物。然後用乙醇清洗除去鹽份。

如果準備是一些沒有很多蛋白質開始的東西，比如質粒準備或PCR清理，那麼隻需要乙醇清洗。

對於獲得高產量和高純度的DNA或RNA來說，去除朝變性鹽是至關重要的。有些套件甚至會用乙醇清洗柱子兩次。

如果鹽殘留，核酸的洗脫就會很差，A230讀數就會很高，導致260/230的比值很低。

對於無乙醇的DNA和RNA，您需要幹燥旋轉

在乙醇洗滌之後，大多數方案具有離心步驟來幹燥柱。這是去除乙醇，對於清潔的洗脫劑至關重要。

當將10mm Tris緩衝液或水施加到用於洗脫的膜上時，核酸可以是水合的並且將從膜中釋放。如果柱仍然含有乙醇，則不能完全再水化核酸。

跳過幹燥步驟會導致乙醇汙染和產量低。我沒有在納米液滴上看到乙醇吸收，所以它不會在你們的讀數中顯示出來。

問題的主要指標是，當你試圖將樣本裝載到瓊脂糖凝膠上時，DNA不會下沉。即使在有裝載染料的情況下。另一個指標是，如果你把樣本放在-20°C，它不會凍結。

RNA和DNA提取，最終的前沿：洗脫

最後一步DNA提取方案是從二氧化矽中釋放出純DNA或RNA。

對於DNA製備方法，通常使用10mm TRIS 8-9之間的pH。DNA在略微堿性pH下更穩定，並將在緩衝液中溶解更快。即使對於DNA顆粒，這也是如此。水傾向於具有低pH，低至4-5，高分子量DNA可能在用於洗脫的短時間內不能完全再水化。

通過允許緩衝液在離心前幾分鍾內靜置在膜中可以最大化DNA的洗脫。

另一方麵，RNA在微酸性的pH值下很好，所以水是首選的稀釋劑。RNA易溶於水。

RNA和DNA提取還會出什麼問題

低產率

如果你的樣本中DNA/RNA的產量低於預期，那麼有很多因素需要考慮。通常，這是一個解體的問題。不完全裂解是產量低的主要原因。它也可能由不正確的綁定條件引起。確保使用新鮮的高品質乙醇(100% - 200度)稀釋緩衝液或添加到綁定步驟。低質量的乙醇或舊的庫存可能含有水分，不是正確的濃度。如果洗滌緩衝液製作不當，你可能會把你所提取的DNA或RNA衝洗掉。

低純度

如果提取的DNA被蛋白質汙染(低260/280)，那麼可能你開始的樣本太多，蛋白質沒有被完全去除或溶解。

如果DNA具有較差的260/230比率，則該問題通常是來自粘合劑或洗滌緩衝液的鹽。確保使用最高品質的乙醇來製備洗滌緩衝液，如果問題持續，請將柱子額外洗滌。

與其他樣本相比，一些樣本含有更多的抑製劑。環境樣品尤其容易出現純度問題，因為在提取過程中腐殖質會被溶解。

腐殖質的性質與DNA相似，很難從矽膠柱中去除。對於這類樣本，專業技術存在以去除蛋白質和腐殖質之前的柱步驟。

退化

這更多的是關於RNA準備和一個在這裏給出關於RNA孤立的具體建議的文章．

主要是在RNA提取過程中，降解發生在樣品存儲不當或裂解效率低的情況下，當然，假設你用無RNA的水洗脫。

對於DNA提取來說，降解不是一個大問題，因為對於PCR來說，DNA可以被剪切，而且工作良好。但如果你不希望有這麼多被剪切的DNA，那麼你可能使用了過於強烈的裂解法。

PCR清理特殊考慮

PCR清理本身顯然不是一個DNA提取技術，但它是一個很好的和簡單的技術，因為它隻是簡單地加入高濃度的結合鹽(通常在每體積的PCR反應中加入3-5體積的鹽)，並通過柱進行離心。

因此，當PCR清理試劑盒失敗時，它會特別令人沮喪。我問人們的第一個問題是“你檢查過凝膠上的PCR結果嗎?”因為你無法用紫外線檢測PCR反應並獲得準確的DNA定量。

在260的PCR反應中吸收紫外線有太多：核苷酸，洗滌劑，鹽和引物。

根據我的經驗，PCR清理工具的失敗經常是由於PCR反應失敗導致的，所以沒有什麼可以清理的。但如果你知道你有一個強聚合酶鏈反應產物，最好的方法是在結合後節省你的流動部分。

如果DNA不能結合，那就是它的位置。你總是可以拯救它，然後再次清理它。然後打電話給技術支持，要求更換工具箱。

勇往直前，滿懷信心地進行RNA和DNA提取

當然，作為科學家，我們想要確切地知道我們的實驗發生了什麼，並且能夠在不需要先呼叫技術服務的情況下排除故障。

我希望這篇文章有助於澄清一些關於用於RNA和DNA提取的二氧化矽自旋過濾器方法的科學知識，這樣您就可以做出自己的診斷和修複。

因此，當您打電話給技術服務時，您將首先仔細檢查一些最可能出現問題的原因，而不是通過大量繁瑣的程序，您可以更快地得到解決方案。即使那是一個免費的DNA提取試劑盒!

希望，您現在更多了解DNA提取套件如何工作。

還有其他你們不明白的關於矽質自旋過濾器的問題嗎?請在下方評論中告訴我們或提出問題，我們將進行討論!

最初發表於2010年6月28日。更新和修訂於2021年10月。