釣魚的microrna歸檔組織?是的,這是可能的!
我們用熒光原位雜交(FISH)技術常規檢測DNA或核糖核酸在組織序列,但微rna (microrna)呢?不用擔心,現在魚是優化以迎接挑戰。幫你走的方法,這就是你需要知道的。
想到的第一件事,當我們想到microrna是他們很小。事實上他們很短,單鏈,隻有18 - 23核苷酸長。它們的大小提出了許多可行性的擔憂魚。他們是足夠穩定,以避免在檔案材料降解嗎?我們可以使探測器足夠敏感的和具體的嗎?這麼小的探頭會輸了擴散嗎?什麼檢測係統適用於信號來自這樣的短期目標?讓我們一個接一個地解決這些問題。
microrna在FFPE部分的完整性
有趣的是,研究表明,microrna在formalin-fixed石蠟包埋組織(FFPE)甚至比mrna更好的保存。1正是因為他們的體積小和緊密結合大蛋白複合物,他們忍受福爾馬林固定,石蠟包埋。不要太放鬆,你需要盡量保持一個核糖核酸酶免費環境。總是使用diethylpyrocarbonate (DEPC)處理過的水為解決方案準備。同時,高壓釜所有靠近的你的實驗!
抗原檢索
在福爾馬林固定交聯可以限製探測和試劑獲得目標microrna。你可以揭開這些網站和幾個抗原檢索程序。大多數協議使用蛋白酶K三羥甲基氨基甲烷緩衝液將甲醛交聯。其他報告,蛋白酶K可能破壞一些抗原表位和建議加熱標本的檸檬酸緩衝。這兩種方法的工作,看看哪個過程更喜歡你的幻燈片。
探針
第一批企業在魚類microrna嚐試digoxigenin標記核苷酸探針。然而,由於微RNA的短長度的目標,雙是不夠穩定。更糟的是,高序列相似性密切相關的microrna使它難以實現足夠的特異性。今天我們主要使用鎖定DNA(放大器)探測器執行方式更好。
鎖定DNA是一個類的DNA類似物的糖環被鎖定在一個N亞甲基橋穩定探測構象。采用探針也因此優化preorganized綁定。他們獲得更高的親和力綁定和更穩定的雙工在更高的溫度下。不匹配的歧視是大大提高,更大的溫差之間存在一個完美匹配的雙工和一個雙工不匹配。這使它更容易找到一個雜交溫度隻檢測到完美的匹配。最後,采用多次/ microrna的混合是抵抗核酸酶攻擊。
控製探針
確保使用正麵和負麵兩種控製探針,尤其是在設置過程。積極的控製應該檢測的microrna的特定組織。至於消極的控製,調查有兩個不匹配和探測特定的microrna是不建議在你的組織中表達。如果你難以區分背景噪音的信號,你還應該包括一個“不調查”的實驗。
雜交和嚴格洗
最好prehybridize prehybridization的部分解決方案在50°C 2 h,然後用探針雜交一夜之間,也在50°C。然後執行嚴格清洗,消除非特異性相互作用的關鍵。你嚴格洗SSC緩衝區中,首先在37°C,緊隨其後的是50°C用顫抖的。第一次洗洗掉多餘的探針雜交緩衝,而第二個消除了非特異性和重複性的雜交。如果非特異性結合仍然是一個問題,試著重複洗幾次。如果你是剛剛開始,你可以玩一些雜交和嚴格的溫度。有時上下兩個學位可以帶來巨大的不同。
探針標記和信號檢測
現在,你可以選擇從一個廣泛的調色板商用寡核苷酸標記示蹤劑。生物素和dioxigenin都有用,因為5 'conjugates,適合immuno-histochemistry的檢測。以防你的組織是豐富的內源性生物素,dioxigenin應該是你的第一選擇。綁定anti-label抗體後,用辣根過氧化物酶(合)的信號放大係統可視化反應。
你也可以選擇一個合適的熒光團合襯底。最常使用的是花青染料,但是Alexa係列或類星體染料也是一種選擇。這是你的選擇。所需的決策主要取決於交貨/ em波長,可能的雙標記,當然,可用性和基金。
哦的可能性…
檢測microrna在FFPE魚的優勢是顯而易見的。你可以想象他們的確切位置在複雜的組織。你可以通過大量的樣品和回顧性檢查它們。現在有協議同時檢測microrna與蛋白質標記2,以及多路複用的方法microrna的魚。3記住,microrna的研究獲得動力,在癌症研究和發育生物學。所以探索你的可能性!
引用
- 泰茲拉夫·m·t·a . Liu, p . VanBelle et al。(2009)微表情分析優於mRNA表達分析在formalin-fixed石蠟包埋組織。國際臨床與實驗病理學雜誌》上2(6),519 - 527頁。
- a·喬杜裏Yelamanchili和h·福克斯(2013)。結合熒光原位雜交檢測小分子核糖核酸和程控immunofluorescent標簽標記。細胞神經科學前沿160(7),頁1 - 8
- n . Renwick p . Cekan Bognanni et al。(2014)多路複用microrna的熒光原位雜交為Formalin-Fixed石蠟包埋組織。分子生物學方法,1211年,頁:171 - 187