苯酚-氯仿萃取的實際應用

雖然有更多的方法可供選擇清除你的RNA或DNA有時酚-氯仿萃取仍然是最好的方法。

在這裏，我將討論使用該技術的一些實際方麵。

一個(非常)簡要指南如何苯酚氯仿提取工作

我們的上一篇文章苯酚是如何提取DNA的涉及到一些關於有機萃取如何從水溶液中去除蛋白質的想法。

簡而言之，蛋白質由疏水和親水殘基組成，通過蛋白質折疊，與水達成妥協，保持可溶性。

然而，當它們有機會過渡到一個既能容納極性殘基也能容納非極性殘基(即苯酚或苯酚-氯仿)的環境中，而不需要任何妥協(即折疊)時，它們會很高興地過渡到那個階段。

極性較高的分子，如碳水化合物和核酸，在水相中“更快樂”(下麵列出了一些例外情況)，並留在那裏。現在來看看真相。

苯酚，苯酚氯仿，氯仿

在培訓某人時，我經常被問到的一個問題是，苯酚-氯仿提取中使用的不同有機相之間有什麼區別。以下是據我所知的分類。

苯酚

我們在這裏討論的是緩衝飽和苯酚，它由72%的苯酚和28%的水組成。

由於苯酚是一種弱酸，我們使用的溶液已經與緩衝液平衡，使pH值達到特定的目標——酸性的用於RNA純化，微堿性的用於DNA純化。

除了一定數量的水溶解到苯酚中，還有一定數量的苯酚溶解到水中——達到平衡時，水相中會含有7%左右的苯酚。

這被認為有助於提取，因為這種溶解的苯酚有助於蛋白質變性，當它們仍然在水溶液中。緩衝飽和苯酚的密度僅略高於水的密度。

Phenol-Chloroform

這是一種緩衝飽和苯酚和氯仿的混合物，通常接近1:1用於DNA純化，有時用於RNA純化的其他比例。異戊醇有時被用作消泡劑，但通常被認為是一種惰性的可選添加物。

這種解決方案是常用的代替有幾個原因。如上所述，緩衝飽和苯酚的密度隻比水高一點。所以如果水相含有足夠多的鹽或其他溶質可以增加它的密度，那麼在萃取過程中就會出現相倒置，水相在苯酚下麵，而不是在苯酚上麵。

氯仿的密度比水大得多，所以把它添加到有機相中會增加該相的總體密度，有助於防止相倒置。

此外，氯仿(還有一些人說的異戊醇)有助於減少兩相之間的模糊邊界，這是由無法決定它們要去哪裏的分子組成的。

這些可能是部分變性的蛋白質，DNA(取決於pH值)，和/或部分變性的DNA結合蛋白仍然附著在DNA上，這是一個真正的痛苦。

如果你在除去水相的時候移走了一些這種物質，那麼你就降低了樣品的純度。如果你在移液時太膽小，那麼你就會損害你的產量。

如果你有我的運氣，那你最想留下的東西就在裏麵。在混合物中加入氯仿有助於減少這種情況。(對於這個問題，我有一個更好的解決方案，我會在下麵告訴你。)

氯仿

這通常在苯酚或苯酚-氯仿萃取後使用。雖然純氯仿在提取蛋白質方麵不如上麵提到的有機溶液，但在從水溶液中提取苯酚方麵效果很好。

還記得我說過平衡後水相含有7%的苯酚嗎?你還記得我說過苯酚會使蛋白質變性嗎?如果你不清除(或至少嚴重減少)現在無蛋白質核酸溶液中的苯酚，它可能會部分或完全抑製你處理DNA或RNA的酶而回來困擾你。

然而，有了一個漂亮的氯仿家，苯酚就會從你的核酸中分離出來。氯仿本身在水中的可溶性比苯酚(約0.8%)低約10倍，對蛋白質的變性也較低。很久以前我也被告知，它不太可能比苯酚顆粒DNA乙醇沉澱很久以前，但我找不到證據支持這一點。

醚

這也可以用來從水相中提取苯酚。然而，由於乙醚的爆炸潛力和生物類型傾向於在他們的實驗室中使用本生燈和電擊器，它在很大程度上已經被氯仿所取代。

不是《紅粉佳人》

注意:如果溶液變粉紅色，不要使用苯酚或苯酚氯仿。

苯酚的氧化會產生粉色/棕色的氧化產物，這可能會導致你的DNA破裂和RNA降解。

大多數商業苯酚溶液都含有抗氧化劑來抑製這種氧化，在酸性pH值下緩衝的苯酚似乎是抗氧化的，但在開始提取之前，把緩衝飽和的苯酚的一部分(從它可能進入的棕色瓶子裏)移到一個透明的瓶子或管子裏檢查一下並不是一個壞主意。

pH值重要很多

偶爾有人會用酚氯仿提取樣本中沒有任何DNA。如果這種情況發生在你或你實驗室裏的某人身上，你的第一個問題應該是“你用的是哪種苯酚?”

同時進行DNA和RNA工作的實驗室可能會同時進行這兩項工作酸性而且基本緩衝苯酚溶液，或者有人會買一瓶新的苯酚而不去注意pH值。

提取含有酸性苯酚樣品的DNA會導致DNA變性，一旦變性，DNA就會分裂為有機相。這是許多公司的一個關鍵特征RNA淨化這是使用酸性緩衝劑飽和苯酚的原因之一。

要了解更詳細的解釋，請閱讀我們的文章酸酚氯仿提取DNA、RNA和蛋白質:三合一．

苯酚pH值的測定

現在，有時實驗室的DNA苯酚提取開始失敗(之後無法回收DNA)，苯酚的pH值就會受到質疑。如果你發現自己處於這種境地，你就不能簡單地浸入水中pH計你不能使用pH值紙，因為紙上的pH值指示器是在水溶液中表征的。

我所使用的方法是將1ml緩衝飽和苯酚與9ml 45%甲醇稀釋，混合，然後用標準pH計測量pH值。

調節苯酚的pH值

最安全的調整方法pH值是用新鮮的約100毫米緩衝水(通常Tris pH 7.9用於DNA工作)替換苯酚溶液頂部的水相，充分混合相，然後讓瓶子靜置，直到相再次充分分離。然後再次pH值。

混合你的階段

苯酚-氯仿萃取的效率驚人——在第一次萃取達到平衡後，平均隻有不到1%的蛋白質留在水相中。當然，關鍵是要讓萃取達到平衡。

兩相之間的表麵積越大，這一過程就越快，你所創造的乳液的表麵積越大。這可以通過渦旋相幾分鍾來實現，正如許多協議所要求的，但不是所有的樣品都可以渦旋。

如果你提純的是非常大的DNA，比如基因組DNA，那麼你可能需要更輕柔地混合樣本，因此每次提取的時間要長得多。因此，在這一點上，遵循您的協議，並非常謹慎地嚐試縮短這一步的時間。

變性和消化的影響

有些方案要求蛋白質變性，並可能在苯酚-氯仿提取前用蛋白酶K消化。這兩個步驟都是為了減少滯留在間期的物質數量，從而提高回收的DNA或RNA的產量。

我從未見過在提取前用SDS變性蛋白的任何負麵影響。另一方麵，蛋白質的消化會降低你回收的核酸的純度。

雖然整個蛋白質幾乎可以保證分割到有機相，但一旦蛋白質被消化成小肽，並不是所有的肽都具有整個蛋白質相同的化學“特性”——每個肽都有自己的分割號。

如果你的核酸中有一些肽，這可能無關緊要，這取決於你的下遊應用，但這些汙染物可能會影響你未來的樣本定量。然而，我發現了一個更好的方法來消除可怕的間期。

鎖相凝膠™

這是那些似乎在50%的實驗室中存在的東西之一，然而，在我交談過的人中，隻有不到10%的人知道它是什麼或它是如何工作的。

我在研究的關鍵時刻發現了這一點，它挽救了我的論文。

簡而言之，鎖相凝膠是一種粘稠的，類似凡士林的凝膠，其密度比水略大。如果你把萃取物放在離心管中，然後將其離心，鎖相凝膠就會聚集在水層和有機相之間，將兩者分離，並在苯酚-氯仿萃取過程中防止DNA/RNA饑渴間相的形成。

我在網上搜索了一下，沒有找到我認為足夠好的圖片，所以我自己拍了一些(圖1)。在這個小演示中，紅色染料代替了我們寶貴的核酸，藍色染料代替了蛋白質。

圖1:在苯酚-氯仿萃取過程中使用鎖相凝膠™。(A)將鎖相凝膠®顆粒放入1.5 ml Eppendorf管的底部。(B)在加入苯酚-氯仿和水相後，水相中完全含有人造DNA(紅色)和人造蛋白質(藍色)。(C)輕輕搖動5分鍾後。離心後(D)。注意凝膠現在將有機相從水相中分離出來。(E)第二次加入苯酚-氯仿，輕輕地搖晃5分鍾後。(F)第二次離心後。現在，人造DNA可以用氯仿(如果空間允許，在同一管中)提取，以去除殘留的苯酚。

如你所見，凝膠在兩相之間形成了穩定的隔膜，如果你想再次提取樣品，而試管中還有空間，那麼你可以這樣做，使用同一個試管兩次或兩次以上，而不影響樣品的純度。

你不能在一個含有這種試劑的管子裏渦旋混合兩種相，但你可以在一個單獨的管子裏渦旋混合，然後把樣品與凝膠一起加到管子裏，然後離心。他們有兩種不同口味的凝膠(請不要吃!)——一種是普通樣品(清淡)，另一種是高密度樣品，比如高鹽或高蛋白質濃度的溶液(重)。

在提取之前使用SDS變性我的樣本中的蛋白質，然後使用鎖相凝膠™分離相，一直給我的DNA樣本260/280比1.8和大於98%的回收率。嚴肅偉大的東西。

真空潤滑脂可替代鎖相凝膠™?

感謝Roberto Rosati發現了一篇論文，表明矽酮潤滑劑(又名真空油脂)已成功用於幫助恢複核酸。

添加這種潤滑脂(它是無毒的和高壓滅菌的)導致了緊密的間相，允許水相的完全恢複。(1）

我們甚至有一個熱心的Bitesize Bio讀者在他們的188bet手机版APP苯酚-氯仿提取過程中測試了這種方法——閱讀他的報告真空潤滑脂是如何成功的DIY相分離凝膠．

在準備這篇文章的過程中，我偶然發現這個網站，裏麵有很多有用的信息。如果你想了解更多關於苯酚的知識，請訪問它。

注意事項

很容易變得自滿我們在實驗室裏使用的化學物質尤其是當我們經常使用它們的時候。苯酚是一種特別令人討厭的化學物質，既有毒又具有腐蝕性。

確保你使用適當的個人防護用品,包括合適的實驗室手套戴上安全眼鏡，知道在發生泄漏或事故時該怎麼做。

現在聽聽你的意見:對於完美的酚-氯仿萃取，你有什麼技巧和建議?

最初發布於2010年5月3日。2021年10月審查並更新。

參考文獻

1.Mukhopadhyay T, Roth JA。(1993)有機矽潤滑劑增強了苯酚-氯仿萃取後核酸的回收率．核酸Res．21(3): 781 - 782。