酸酚氯仿提取DNA、RNA和蛋白質:三合一

在緊縮時期，沒有什麼是多餘的。除了可以用額外的資金注入來補充的節省試劑外，還有一種商品是不容易補充的——組織樣本!

如果你像我一樣，經曆過沒有足夠的樣品從同一樣品中進行qPCR、western blot和傳統PCR的恐懼，你可能會訴諸酸酚氯仿提取。有了這種技術，你可以利用它們不同的物理和化學性質進行分割，一次得到3個生物分子。這種分離所需的物質很好地包裝在TRIzol試劑中，或稱TRIreagent。然而，有人說它的成本更低自製提取試劑。

在你即將讀到的段落中，我將描述這一技術背後的科學原理和充分利用它的技巧!

酸酚氯仿萃取樣品的製備

你可以使用均質器來破壞細胞，但我真心建議用它來粉碎組織液體氮，然後加上試劑盒．看起來比較幹淨。另外，根據我的經驗，你也可以在切碎的組織中加入TRIzol，然後把管子放在旋轉的輪子上半小時。這將裂解相當數量的細胞以分離出足夠的物質。

用低pH值分離核酸

均質後加入氯仿，全速離心。你應該看到三個清晰的相-紅色的有機相，白色的間相和清澈的水相。

背後的科學:正如尼克之前解釋的那樣——苯酚溶解分子；蛋白質(由於許多疏水氨基酸側鏈)在其疏水側翻轉，並保持在有機相中。

DNA和RNA有磷酸二酯如果pH值為7-8，兩種核酸都在極性水相中。但我們要把他們分開，而且要活著!這就是為什麼pH值要調整到酸性(4.5 4)。在這個pH值下，DNA上的磷酸基被H+中和，DNA變成沒有被指控的．不帶電的DNA進入有機相。RNA停留在水相中因為pKa它的基團比DNA的多(它的酸性更強)。這個特性使分離一個分子而不破壞另一個分子成為可能。

是什麼氯仿？苯酚單獨保留10-15%的水分，導致RNA損失相等;氯仿阻止了這一點，因為它可以和苯酚混溶，但它的密度更大，所以它把苯酚從水中吸走，產生分離更清晰的．它也是苯酚的好搭檔變性蛋白質它能溶解脂質。

關鍵的一點:如果你使用自製的TRIzol，用水飽和苯酚，而不是緩衝液。這是因為pH值是這一步最重要的特征。此外，自製溶液不會產生紅色有機相。為了避免混淆，記住氯仿的密度比水大得多，有機相總是低的。

協議擴展:如果你有紙巾在RNA穩定緩衝液，你可以加入TRIzol，在-20°C冷凍，保存幾天。

從水相中沉澱RNA

當你把上麵的水相吸出後，通過加入異丙醇來沉澱RNA。用75%乙醇洗淨顆粒並溶解DEPC水．

背後的科學:一個非常重要的成分在這裏(包含在TRIzol試劑)，使分離高質量RNA是胍異硫氰酸酯．它是一種抗潮劑，是最有效的蛋白質之一變性劑。因此它有效地禁用了核糖核酸酶．它還有助於將rRNA從核糖體蛋白質中分離出來。

我們使用異丙醇通過鹽析原理沉澱RNA。洗滌用75% EtOH除去水溶鹽，而洗滌試劑的乙醇部分保持RNA沉澱。

臨界點:當你移液時，小心不要轉移一些有機層，你就會用DNA汙染RNA。

協議擴展:可加入異丙醇，-20°C保存過夜。這給了你更多的時間來進行DNA分離，而不用一次分離所有的東西。另外，如果你把RNA的分離留到第二天(或稍晚)，你就有時間立即將其反轉錄為cDNA，這比RNA更穩定。

不經蛋白質水解而從蛋白質中分離DNA

在有機階段有DNA和蛋白質的混合物。用乙醇沉澱分離DNA。洗淨並晾幹DNA顆粒，將其重新懸浮在水中，TRIS或NaOH溶液中。

背後的科學乙醇隻能使DNA顆粒化，因為蛋白質很容易溶解在苯酚中。使用s討厭檸檬酸/ EtOH溶液作為第一洗滌試劑。檸檬酸鈉也是一種朝斜藻;它會去除一些剩餘的蛋白質。使用75%乙醇進行第二步洗滌，就像RNA顆粒洗滌一樣，去除鹽分。

臨界點例如這對我很重要等沉澱劑、乙醇蒸發，因為如果乙醇沒有變幹，顆粒不會完全溶解。

協議的變更:你可以把管子和溶解劑(我用的是水)放在4°C下過夜，以確保更好的產量。

沉澱蛋白

用異丙醇從最後剩下的苯酚-乙醇溶液中沉澱蛋白質，用鹽酸胍洗滌小球，溶解在SDS中。

背後的科學：異丙醇由於它的極性比乙醇低，所以顆粒能排出蛋白質。的胍鹽鹽洗衣液能使蛋白質變性，因為它是一種嗜潮劑。

缺點:唯一辛苦的時刻是溶解小球。這種方法得到的是難以溶解的顆粒。用水浴或超聲波浴打碎顆粒;根據我的經驗，或者兩者都有。盡管如此，如果你把含有SDS的小球加熱一段時間，並對其進行聲波處理，你就可以得到用於WB分析的合理數量的蛋白質。

總之……

酸-酚-氯仿萃取法背後有趣的事實是，它是1987年一項技術的延伸紙這獲得了超過60000次引用。它在世界上排名第五生命科學領域被引用最多的文章．我當然同意這是一個有用的技巧，你呢?