評估蛋白質純度和質量的五種方法

如果您曾經在實驗室中與蛋白質打交道，您可能知道蛋白質的純度和質量對下遊應用有多重要。在這篇文章中，我們將回顧“壞”蛋白質樣本所遇到的眾多問題，以及如何在將您喜愛的蛋白質用於重要實驗之前分析其純度和完整性。

蛋白質樣品質量差導致的問題

無論你的蛋白質是不純的還是質量差的，壞的樣品會導致大量的問題，導致實驗的不準確性和低精度——有時甚至會導致實驗完全失敗!以下是一些需要注意的具體問題:

1. 蛋白質可以錯誤折疊，聚集，沉澱出溶液，這通常是一個不可逆的過程，如果沒有仔細控製(如在一個鹽沉澱)．聚集和降解也會導致蛋白質不能像它們的原生狀態那樣“表現”，所以它們可能不能正確地與其他蛋白質或分子結合。有時用肉眼可以清楚地看到樣本中的聚合，但情況並非總是如此。
2. 當酶失活或錯誤折疊時，酶法測定就會失敗或導致重現性差。如果你正在使用酶的測定作為其他感興趣的蛋白質的指標，這可能是特別重要的!
3. 蛋白質水解會導致上述問題，除了有失去精心構建的功能標簽的風險。雖然有一些劑可以減少蛋白質樣品中的水解和降解，但當蛋白質儲存在水溶液中時，總會有水解的風險。

顯然，花些時間仔細控製影響蛋白質質量的因素是很重要的。你可能可以控製存儲條件，包括pH值、緩衝液、鹽濃度、蛋白質濃度、儲存溫度。也就是說，即使在最理想的製備和儲存條件下，蛋白質的質量也會隨著時間的推移而變化。這意味著你應該定期檢查你的蛋白質樣本，以確保它們符合你的實驗要求!

在開始耗時或昂貴的技術之前花點時間檢查一下蛋白質的質量，從長遠來看確實有助於節省時間和金錢。

測定蛋白質純度和質量的可靠方法

1. 一般定量:UV-Vis, Bradford和活性測定

測定蛋白質的濃度本文後麵介紹的許多方法通常都需要示例才能有效。

而紫外可見分光光度法而且布拉德福德化驗是高通量的，幾乎在每個生物化學實驗室都使用，相比酶活性測定．這是因為UV-Vis和Bradford測定結果取決於總計樣本中的蛋白質，而不僅僅是你感興趣的蛋白質。相比之下，活性測定是目標特異性的，並有額外的好處，測量的分數活躍的純化樣品中的蛋白質。然而，並不是所有的蛋白質都可以用活性測定法定量。

2. 尺寸分析:電泳(原生/變性PAGE)

和上麵描述的量化方法一樣，電泳也被生物化學家廣泛使用，它可以提供目標蛋白質的大小以及是否存在其他蛋白質類雜質的總體情況。然而，在進行電泳之前，你會想要獲得蛋白質濃度的近似值——以免你在周五晚上6:30重複使用凝膠!

有幾種類型的電泳方法，最常見的是變性sds - page．樣品首先用SDS(一種洗滌劑)變性，然後在電場作用下在聚丙烯酰胺凝膠基質上按質量分離。在本地的頁麵在美國，蛋白質分離更加複雜，它是基於淨電荷、大小、而且原生結構的形狀。在這兩種技術中，你都可以通過“塗抹”條帶來識別樣品中是否存在降解現象——但如果凝膠中蛋白質過多，也會發生降解。

電泳的一些挑戰包括它不能顯示低水平的雜質或微小的尺寸差異。電泳也需要濃度在0.1到2mg /mL之間的樣品才能提供清晰的結果。

3. (更多)尺寸分析:質譜分析

質譜分析是一種非常強大的分析技術，可以識別翻譯後修改，具有很高的準確性和精確度，這是不容易用上述技術可視化。電離質譜的工作原理是按質量和電荷分離蛋白質或多肽，將它們加速到探測器上，為每個蛋白質(或蛋白質片段)創建一個獨特的光譜。

單純依靠質譜法評估蛋白質質量的缺點是，它的通量相對較低，需要大量的樣品準備。此外，很難評估樣本中的蛋白質是否完整，因為這個過程是變性的，不能識別錯誤折疊事件。

4. 均勻性:動態光散射

如果用上麵的方法你的蛋白質看起來很純，是時候檢查一下確保它在樣品中分散了(也就是說，沒有聚集)。動態光散射(DLS)使用偏振光激光來測量含有小分子(或者在我們的例子中是蛋白質!)的樣品的衍射水平。發生的散射量是樣品通過儀器時溶液中粒子的流體動力半徑的影響。

雖然DLS是一種易於使用的技術，可以提供優秀的定性信息，但它不能提供蛋白質樣本中大小分布的完全全麵的圖像，因為聚集物很容易淹沒檢測器。這種技術也不適合評估四元結構(即，二聚體與單體)。話雖如此，DLS的便便性及其隨時間變化顯示集合體形成的能力使其成為評估均質性的廣泛使用的方法。

5. 微流控擴散上漿(MDS)(射流分析)

微流體擴散上漿(MDS)流動性的一個流控分析的係統是一種快速和簡單的選擇，可以測量蛋白質的大小和濃度，這兩者一起提供了一個很好的質量指標。MDS使用微流控芯片將蛋白質樣本運行到一個通道中，在那裏它與輔助流體一起以穩定的層流流動——沒有混合。蛋白質從一種流到另一種流的唯一途徑是擴散，擴散的速率與它們的大小成正比(水動力半徑R_h)擴散一段時間後，兩種蛋白質流再次分離，並對蛋白質進行標記。用擴散和未擴散的比值來計算R_h．

MDS避免了其他技術的一些缺陷。蛋白質和基質之間不存在相互作用，就像在電泳中那樣，樣品是在原始狀態下運行的。所需的工作流程很簡單，使用濃度低至~10 μ g/mL的樣品可在10分鍾內得到結果。

我應該用什麼方法來分析我的蛋白質?

選擇測量蛋白質樣本的數量、純度和整體質量的技術可能會讓你不知所措——但這樣做會為你省去很多頭疼的事情!雖然有很多可用的技術，但你不必隻選擇一種——上麵描述的所有技術都可以相互配合使用，以提供最準確和全麵的蛋白質樣本狀態圖像。

參考文獻

• 微生物細胞。2014;13:180。純化蛋白樣品的質量評估和優化:為什麼和如何?https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4299812/
• 蛋白質純化．