New England Biolabs, Inc. (NEB)成立於20世紀70年代中期，是分子生物學應用酶的發現和生產的行業領導者，現在為基因組研究提供最大的重組酶和天然酶選擇。NEB將繼續擴大其產品範圍，包括PCR、基因表達、用於下一代測序的樣品製備、合成生物學、糖生物學、表觀遺傳學和RNA分析。此外，NEB還致力於加強聯盟，使新技術能夠進入關鍵市場領域，包括分子診斷開發。新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)是一家私人控股公司，總部位於美國馬薩諸塞州伊普斯維奇(Ipswich)，通過在加拿大、中國、法國、德國、日本、新加坡和英國的獨家經銷商、代理商和七個子公司網絡在全球擁有廣泛的分銷渠道。有關新英格蘭生物實驗室的更多信息，請訪問內．
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內容由新英格蘭生物學實驗室
簡介
你知道嗎?僅僅在短短10年前，利用基因工程來改善某些人類疾病的想法還被視為“科幻小說”。
雖然細胞突變研究和基因敲除實驗在基因工程之前是可行的，但它們不是很可靠。事實上，由於這些老方法的隨機性和不精確性，需要徹底篩選讀出的數據，以確保正確的基因組成。
隨著鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活子樣效應核酸酶(TALEN)、定期聚類間隔短回文重複序列(CRISPR)，研究人員可以改變基因組，使其具有更多的位點改進特異性。這篇文章將集中在轉錄激活子樣效應核酸酶(TALEN)，這是一項偉大的技術，在世界各地的許多實驗室使用。
一點背景知識
在我們了解TALENs如何工作之前，我們首先需要確保我們涵蓋了DNA修複機製的基礎。
為了改變我們基因組中的遺傳信息，需要雙鏈斷裂(DSB)。正如你所能想象的那樣，自然力量(如紫外線或化學物質(致癌物))對你的基因組進行破壞或任何修改都可能對你的細胞和人類的生存造成致命的影響。所以，當一個DSB由核酸酶產生時，我們細胞中的緊急DNA修複係統會自動啟動並試圖修複受損的DNA堿基，恢複DNA雙工。
研究人員利用這一自然過程開發了更精確的基因組編輯協議。通過將核酸酶以特定的序列引導到特定的DNA位置，該酶將在不同的結合位點進行DSB。
然而，與大多數生物係統一樣，DNA修複機製並不是那麼簡單。實際上，根據DSB的位置和模板的順序，可能會發生兩種情況。第一種情況是非同源末端連接，這可能導致一般的幀移位、插入和刪除。第二種情況是同源末端連接，它需要某種類型的模板(原始的或人工的)，通常會根據所提供的模板進行精確連接。(參考線1，圖1)
人才是如何工作的?
那麼這一切和TALENs有什麼關係呢?一切!
TALEN背後的關鍵技術是使用轉錄激活子樣效應器(TALE)來結合特定的DNA序列。當與FokI這樣的核酸酶結合時，切割位點的精度是非常高效的，因為FokI核酸酶需要二聚。因此，包含目標區域的正向序列和反向序列都必須精確。此外，您還可以將其他功能與TALE配對，例如抑製子等。
TALEs代表了來自中國的III型效應蛋白家族黃spp。革蘭氏陰性變形菌屬，常與植物疾病有關。這些聰明的微生物已經發展出自己的方法來控製植物的基因表達，主要是通過TALEs。故事可分為3個部分:1)n端分泌和轉運信號;2)中心DNA結合域(DBD);3) c端核定位域(圖1)。
對TALEs的dna結合域如何起作用的調查是由卷等．而且Moscou等．這些研究小組發現，dna結合的中心區域由多個34個單位長的重複氨基酸(aa)序列區域組成(圖2)。秘密是，在每個重複區域內，科學家發現位置12和13是序列特異性的決定因素(4)。這意味著研究人員可以設計位點特異性序列，使TALEs結合;一旦到達，栓係的Fokl內切酶將執行DSB(圖2)。
圖1。TALE的結構示意圖。Xanthomonas spp的基本TALE結構。n端(紅色)負責細菌分泌和轉位信號。中部區域(藍色)是DNA結合區域。c端核定位信號域(黑色)。
圖2。TALE的再工程示意圖。中心結合域包含多個重複氨基酸序列的區域(位置12和13是對特定核苷酸識別最關鍵的)。DBD, DNA結合結構域。FokI, fk1核酸酶。
應用程序
在體外利用細胞係進行誘變研究
這是測試TALEN設計是否正常工作的最簡單方法，通常也是邁向更多目標的第一步在活的有機體內研究。介紹你們的TALEN構建物比較直接，因為它涉及到用你們的質粒構建物轉染細胞係(參考文獻3，圖3)。例如，人胚胎腎細胞係(HEK 293T)和HeLa細胞係由於易於轉染，是驗證基因表達和基因型的典型選擇。
在活的有機體內基因組編輯
研究人員接受TALEN技術的主要原因是其直接靶向性將同源重組的頻率提高了幾個數量級(1,3)。通常情況下，用同源模板進行同源重組進行修複的情況非常罕見，而雙敲除則更加困難，尤其是在哺乳動物細胞中。在TALEN編輯技術可用之前，科學家們經曆了密集的雜合突變篩選，然後在實驗動物之間進行交叉，以實現純合敲除。TALEN技術已經在許多應用中證明了它的通用性，從單細胞模型如酵母到多細胞生物，如果蠅，小鼠，斑馬魚和人類幹細胞(2,5)。
TALEN的其他修改
有趣的是，您可以將TALE與其他效應器配對，以誘導其他效果。例如，你可以把FokI核酸酶換成Kruppar -associated box transcription repressor (KRAB)用於基因沉默實驗(6)。有人假設KRAB的抑製活性可能通過介導負輔因子(9)發揮作用(9)。另一方麵，如果你想要過度表達某些基因，你可以嚐試將TALE與合成的VP64結構域連接起來，該結構域由來自單純皰疹病毒(HSV-1) VP16結構域的最小亞基組成，該結構域可以招募內源性的基因表達激活因子(7)。你可以在VP64上添加一個名為cryptochrome2 (CRY2)的光開關，並連接到VP64上，形成一個光激活的基因表達模型(3)。它的工作原理是，特定波長的光會改變CRY2的構象，並與連接器(C1B1)結合。然後C1B1會吸引VP64結構域(3)。與其他基因過表達模型相比，這是誘導/關閉感興趣基因的時間表達的理想模型。
結論
這就對了!TALEN對於分子基因組工程師來說是美妙的，我相信每一天，更新更好的利用TALEN的方法都會被揭示出來。如果你有興趣找出TALEN和CRISPR之間的差異，請隨時查看Bitesize Bio的以下文章:188bet手机版APP
參考文獻
- 萊特等。talen介導的基因組編輯:展望與展望。生物化學雜誌．2014;462(1): 15 - 24。DOI: 10.1042 / BJ20140295
- 種子等。選擇合適的工具:RNAi, TALEN或CRISPR。摩爾細胞．2015;58(4): 575 - 585。DOI: 10.1016 / j.molcel.2015.04.028
- Nemudryi et al。TALEN和CRISPR/Cas基因組編輯係統:發現的工具。Acta Naturae．2014; 6(3): 19-40。PMID: 25349712。
- 卷等。tali型效應因子的DNA結合特異性破譯。2009;326(5959): 1509 - 1512。DOI: 10.1126 / science.1178811
- 丁等。用於生成基於人類幹細胞的疾病模型的TALEN基因組編輯係統．細胞幹細胞；2013.12(2): 238 - 251。DOI: 10.1016 / j.stem.2012.11.011
- 拉舍爾et al。Krüppel-associated盒子是有效的轉錄抑製區域．PNAS．1994;91(10): 4509 - 4513。DOI: 10.1073 / pnas.91.10.4509
- Perez-Pinera et al。合成轉錄因子組合的協同和可調的人類基因激活。Nat方法．2013; 10(3): 239 - 242。DOI: 10.1038 / nmeth.2361
- Moscou et al。黃單胞菌使用一種基於氨基酸的代碼，以特定的DNA序列目標效應分子。2009;326(5959): 1501。DOI: 10.1126 / science.1178817
- 彭等。克虜伯相關盒(KRAB)轉錄抑製區域的生化分析醫學雜誌。化學。2000;275(24): 18000 - 18010。DOI: 10.1074 / jbc.M001499200