低溫電子顯微鏡樣品準備:5個關鍵考慮因素

Cryo-EM提供了一種接近生物分子原子分辨率結構的方法，非常適合成像蛋白質和DNA。但如何才能確保獲得令人印象深刻、信息量大的低溫電子顯微鏡圖像呢?關鍵是要做好低溫電子顯微鏡樣本準備。

所有用低溫電子顯微鏡解決的結構都是從水溶液中的完整標本開始的。

但是，是什麼使樣本適合於低溫電子顯微鏡呢?它對他們有什麼要求?你們靠什麼來控製質量呢?

無論你是準備開始一個涉及低溫電子顯微鏡的雄心勃勃的項目，還是隻是想擴大你在該領域的知識，我們都為你覆蓋。

請繼續聽我講，我將介紹低溫電鏡樣品準備的5個基本考慮因素，以最大化您的結果。

低溫電子顯微鏡:一個非常簡短的回顧

低溫電子顯微鏡是電子顯微鏡在低溫(< 150°C)保存的樣品上進行。對於這篇文章，我們關注的是低溫透射電子顯微鏡(TEM)。低溫電子顯微鏡利用了兩種強大的技術。單粒子分析以及非晶冰的形成。它們共同提高了低溫電磁的分辨率極限，超過了傳統TEM。

因此，它可以使蛋白質、病毒和細胞器等生物樣本的結構以接近原子的分辨率得到解決。

最後，為了讓這些樣品在電子顯微鏡下可視化，它們必須首先被應用到樣品網格上。網格是一個平坦的表麵，使樣品能夠被放入顯微鏡。我們將在後麵更詳細地討論網格。

如何為低溫電鏡準備樣本?

在進入樣品製備的細節之前，讓我們看看整個低溫電子顯微鏡樣品準備工作流程(圖1)。

圖1概述了整個樣例準備過程，它們是如何大致分類的，以及每個類別中可優化的參數。

我們將以顯示的五個類別為例，更詳細地討論它們，盡管順序略有不同。

5個低溫電子顯微鏡樣品準備技巧

1.用電子陰性染色顯微鏡檢查自己

負染色電子顯微鏡是你的終極質量控製方法。[1]

有很多傳統的實驗室技術可以檢測樣品的質量，我會講到這些。

但是。

陰性染色顯微鏡可以讓你實際看到你的樣品。看到你的樣本的所有榮耀或醜陋，而不用經曆冗長的手續和全麵的低溫電子顯微鏡。

可以把它看作是低溫電子顯微鏡的守門人。

在你的陰性染色顯微照片上看不出單個的樣品分子嗎?好了，回到繪圖板上因為你的低溫電鏡樣品準備工作還需要改進。

什麼是負染電鏡?

這是另一種TEM。透射電子顯微鏡的一個主要特征是樣品透射的電子量與透射率成反比原子序數構成它的原子。

不囉嗦的說法是，較輕的元素(如碳和氧)比重元素(如鋨和鈾)傳遞電子更好。

負染電子顯微鏡將這一點發揮到了極致。

通常,所有不是你的樣品被一種含有重原子的汙跡浸透了。它們從顯微鏡光束中吸收入射的電子。與此同時，你的樣品傳輸電子，使它們被探測器看到。

把它想象成從裏麵切出餅幹的曲奇麵團。剩下的麵團是陰性染色劑，上麵的星形孔是樣品分子。

使用的負色斑包括:

• 鈾酰乙酸;
• 鈾酰甲酸;
• 四氧化鋨;
• 磷鎢酸。

為什麼它是低溫電子顯微鏡的守門人?

簡單。它使用的顯微鏡相對普通，也相對便宜。例如,Thermo Scientific™Talos™L120C TEM是合適的。如果你的研究所有顯微鏡套件，可能會有一台顯微鏡足夠進行陰性染色顯微鏡。

但是不要太興奮——陰性染色的分辨率極限大約是20 Å，如果你能達到這個分辨率就很幸運了。

這就是為什麼它是一個饋線技術。

在進行陰性染色顯微鏡檢查時，最後兩點:

1. 嚐試幾種負色斑。
2. 適用於低溫-電磁網格製備的樣品考慮因素。

關於第一點，它們可以與你的樣品發生反應，通常是在不飽和脂質中添加碳-碳雙鍵。在這種情況下，它們必須被明智地使用。

當你的樣品中沒有這樣的基團與之反應時，染色劑可以通過使樣品分子之間的區域對入射的電子不透明而被動地起作用。

此外，有些汙漬會與樣品緩衝液一起礦化。例如，醋酸鈾酰與磷酸鈉反應生成結晶磷酸鈾酰。這些在你的顯微鏡上看起來就像巨大的羅夏墨跡。

關於第2點，我將在適當的時候討論網格準備。

2.樣品純度

恐怕這裏沒地方躲了。你需要一個純樣本。我的意思是非常純，99%。

你可能知道該怎麼做。親和色譜法．Size-exclusion-chromatography．sds - page．一次又一次。

這裏我幫不了你什麼，因為你的工作流程與你的樣本緊密相連。

在你嘲笑我，說我在逃避之前，讓我給你指出一些不可錯過的資源!

從這裏開始188bet手机版APP測定蛋白質純度和質量的生物指南．

如果事情變得棘手，你可能想要擴展和嚐試離子交換色譜法．也有大量親和標記你可以試著從它粘稠的基質中提取樣本。

如果樣本是蛋白質，188bet手机版APPBitesize Bio有一本關於蛋白質表達的優秀電子書再來一個蛋白質純度和質量測定．

3.集中、同質和活躍的重要性

有用的事實放在最上麵。所以你看:

濃度

考慮到網格尺寸(見後文)，一個濃度在10 nM到10 μ M之間的均勻活性樣品的幾百μ L應該足夠了。請允許我詳細說明。

低溫電子顯微鏡分析單個粒子。如果你眯著眼去記阿伏伽德羅常數，你可能記不起來。你可能記得，這是一個很大的數字。

這對你我來說是個好消息，因為這意味著即使在最微小的液滴中，也有數萬億的分子。

所以你不需要很高的樣本濃度。特別是當與x射線晶體學在這種情況下，你的樣品必須過飽和才能誘導結晶。你也不需要一個大的樣本體積。

記住，在低溫電子顯微鏡中，你分析的是單個粒子。為了構建一個可以模擬結構的電子密度圖，你需要挑選1萬到10萬個粒子進行單粒子分析。[２]

所以你的樣本分子必須足夠密集，在每張顯微照片上都能區分出來。

同質性

同質性是另一回事。在低溫電子顯微鏡中，樣本中的每個分子都必須采用相同或幾乎相同的構象。

為什麼?因為顯微鏡上所有的1000個指定的分子在理想情況下應該編碼相同的結構信息。這使你能夠建立一個強大的“信號”，你可以從背景中提取。記住，電子顯微照片是低對比度的。

但要達到同質性並不容易，因為生物分子通常是靈活的。

同樣，產生同質樣本的實際步驟完全取決於你的樣本。

我們有很好的建議用於提高細菌蛋白質的表達如果你想成像蛋白質。如果你研究的是膜蛋白，所有鏈接中的信息都適用。但是，你也需要盡可能多地去除多餘的洗滌劑/增溶劑．

病毒呢?這是一個合理的問題，因為低溫電子顯微鏡特別適用於大分子。你可以在文獻中讀到一些有用的策略。[3]

要檢查樣本的同質性，請嚐試:

1. 粒徑排除色譜(AKA凝膠過濾);
2. 動態光散射;
3. 負染電子顯微鏡。

隻要有足夠的時間和創造力，你就會在準備優秀的樣品方麵變得無雙。

活動

為什麼要費心去研究一個不活躍的生物分子呢?為什麼要給變性的生物標本成像呢?

你可以說，沒有活動，就沒有生物學。所以要花些精力來展示你的樣品的活性，尤其是因為它的活性形式可能在淨化過程中給你帶來的麻煩最少。

最終，你知道什麼化驗是最合適的。如果沒有，那就去查閱相關文獻。

4.選擇正確的網格

現在我們要進入最重要的部分了。

低溫電子顯微鏡中的網格本質上是3毫米左右的小支撐物，使你能夠將樣品管理到顯微鏡中。[4]

在理想的情況下，它們將樣品的單分子厚薄膜呈現給電子束。

網格通常由銅或金製成。每個網格都被劃分為樣本所在的正方形網格。

有許多類型的網格和專有技術．正確的網格選擇對你的低溫電磁實驗的成功至關重要。

我不會一一列舉，但主要的低溫電子顯微鏡網格類型有:

• 石墨烯;
• 氧化石墨烯;
• 多洞的碳;
• 萊西碳。

通過試錯和先驗知識的結合，您應該能夠指定一種類型的網格來開始您的工作。

疏水性和低溫-電磁網格的選擇

疏水性是一個關鍵因素。非孔洞和非花邊網格直接吸附樣品到固體表麵。如果這個表麵是石墨烯或其他碳同素異形體，它會強烈吸引疏水蛋白質，這可能導致電網擁擠。

多孔和花邊網格可以避免這種情況，因為它們由穿孔薄膜組成，通過表麵張力將樣品固定在適當的位置。消除連續的固體支撐也會產生更少的噪聲，因為固體支撐會分散電子，導致噪聲。

我給你最好的建議是去讀文學作品。看看人們用什麼樣的網格來表示與你相似的樣本，然後開始使用它們!

5.優化您的網格準備

好的。因此，我們知道哪些網格是可用的，但適當地準備網格也同樣重要。

典型的低溫電子顯微鏡柵格製備方案可能是:

1. 離心樣品以除去聚集物。
2. 同時，輝光放電低溫電磁柵。
3. 將3-5 μ L的樣品塗於網格上。
4. 讓樣品靜置3-30秒。
5. 吸幹多餘的液體。
6. 用3-5 μ L的水衝洗樣品。
7. 吸幹多餘的水分。
8. 玻璃化的示例。
9. 插入顯微鏡觀察。

這個工作流非常基礎，但是它演示了幾個可以優化的參數。有這樣的機器人Vitrobot這使得整個過程是半自動的。稍後再詳細介紹。

注意，陰性染色電子顯微鏡的網格準備是手工的，沒有任何玻璃化步驟。所以，這是一個很好的方法來確定你的技術。

樣品的體積，樣品在網格上停留的時間，洗滌步驟的數量和長度都可以優化。你甚至可能不需要清洗步驟。

你可能會麵臨的主要挑戰有:

1. 可靠地製備具有適當樣品厚度的網格。
2. 網格/ /擁擠。
3. 有效地玻璃化你的樣品。

有一些無汙點的方法可以提高可靠性，但它們有點專業。［5］

輝光放電是一個簡單的過程，通過使用電離氣體來降低網格的疏水性。通常使用空氣並在電網上產生負電荷。其他氣體混合物可以用來引入正電荷。然而，不要煩惱，因為發光放電是常見的。

更詳細的玻璃化

玻璃化。我們已經提過幾次了。但它是什麼，你怎麼做，哪裏會出錯?

這是一個將樣品快速冷卻到低溫的過程，這樣就不會形成冰晶。低溫電子顯微鏡對生物樣品的保護至關重要。

的過程將樣品玻璃化稱為驟凍．它需要將你的樣品在電磁網格上浸入(通常是)液態乙烷中。然後，必須在不加熱或不接觸空氣的情況下，將網格送入顯微鏡。

這是因為空氣中的水分會立即開始凍結在你的樣品上，破壞它。

幸運的是，驟降冷凍的精細特性和對自動化係統的需求，促成了前麵提到的Vitrobot的發展。

從錯誤中吸取教訓

讓我做一件科學界不常做的事，分享我的一次失敗。參見下麵的圖2。這是膜蛋白的陰性染色顯微照片，我完全沒看到。

如果有足夠的時間，我會嚐試這裏提出的所有想法。但是我沒時間了。

我舉這個例子是因為你的網格不應該看。事實上，它不是均勻的灰色或黑色，這意味著那裏有蛋白質。那就是那些看起來像白噪音的東西。

但它是完全毫無特色。沒有單個粒子可見。那是因為有太多的樣本粘在網格上了。我試著將樣品稀釋1000倍，但沒有成功。我接下來要做的就是改用多孔碳柵格，但正如我所說，我沒時間了。

記住，樣本優化是一個過程。

低溫電子顯微鏡樣品準備的其他注意事項

這裏有一些獎勵給已經走到這一步的讀者。

額外提示1:自旋濃度會傷害樣品

我們已經提到過，與x射線晶體學不同，低溫電子顯微鏡不需要高得離譜的樣品濃度。

這裏有一個小提示。如果你已經將凝膠過濾作為樣品純化過程的一部分，並在色譜圖上得到一個漂亮的高斯峰，試試這個:

取對應於峰值頂點的分數，並將其直接應用到您的樣本網格中，而不需要任何額外的工作。這消除了樣本損害，節省了您的時間，並且可能正是您正在尋找的最佳點。

如果網格太擁擠，你可以準備稀釋。如果網格看起來是空的，那麼你就知道樣品濃度是不可避免的。

額外建議2:盡早獲得正確的幫助

如果你在大學或跨學科研究所工作，你的顯微鏡套件的用戶可能分為兩類:

1. 材料科學家。
2. 生物科學家。

這是一個籠統的說法，當然，並不是普遍正確的。然而，材料科學家通常分析納米材料和由堅固的化學成分組成的類似物體。他們在網格製備方麵的專業知識可能不適用於生物標本。

我掉進了這個陷阱，浪費了很多時間。

如果你幸運的話，有人對生物樣本進行過顯微鏡檢查。或者，試著從對不同類型的標本有廣泛經驗的人那裏尋求支持。

安定下來

這就是我在低溫電子顯微鏡樣品準備方麵的知識。好吧，無論如何，這些知識都值得分享!我讓你們自己來判斷。

如果你覺得這些都有幫助，請在下麵的評論區告訴我!如果你想讓我添加或修改任何信息。我們一直在學習!

參考文獻

1. 歐嗨M，李燕，程燕，Walz T (2004)陰性染色和圖像分類-現代電子顯微鏡的有力工具．proc在線雜誌6: 23-34
2. 迪拉德RS，漢普頓CM和施特勞斯JD等．(2018)冷凍電子顯微鏡尖端的生物學應用．Microsc Microanal24: 40619
3. 詹姆斯K，庫尼B，阿戈普索維奇K等．(2016)高通量純化感染性病毒粒子的新方法．Sci代表6: 36826
4. 湯普森射頻等．(2016)介紹結構生物學用冷凍電子顯微鏡製備樣品和成像．方法One hundred.: 3日- 15日
5. Stefan一等．(2017)從納升大小的蛋白質樣品和單細胞提取物製備無印跡和無損冷凍電子顯微鏡網格．J結構生物學觀點》197: 220 - 26
6. 斯格羅·G和科斯塔·T (2018)用於單粒子分析的膜蛋白樣品的低溫電子顯微鏡網格製備．摩爾Biosci麵前5: 2296