低溫電子顯微鏡簡史

如何獲得諾貝爾獎?

絕對是大量的腦力勞動。把你的研究生涯押在一個合法的前沿領域上的遠見和勇氣會有所幫助。冒著被嘲笑的風險提出正確問題的洞察力是必須的。

意外的驚喜。

低溫電子顯微鏡(冷凍- em)在2017年獲得諾貝爾化學獎時，似乎不知從哪裏進入了主流。

此外，問題、結果和時機交織在一起，造就了一個有趣的故事。

讓我們後退一步。享受冷凍電子顯微鏡的短暫曆史。

形象的力量

一個黑洞。圖坦卡蒙的死亡麵具歐內斯特·沙克爾頓的沉船耐力．

這些有什麼共同之處呢?

沒錯，他們都被拍到過。

任何學科的進步都要歸功於一張圖片，這是無法低估的。這是不言而喻的。因此，在某種程度上，人們付出了巨大的努力，把上麵列出的物體和其他許多物體成像。

同樣的道理也適用於原子世界。

一個多世紀以來，x射線晶體學一直是捕獲分子圖像的主要技術。其巨大的科學貢獻體現在其先鋒獲得的諾貝爾獎數量上。大約15。[1]

x射線晶體學的局限性

生物是動態的;一個簡化的方法來解決他們的組成部分，一點一點，永遠不會提供一個完整的理解他們。

捕獲生物過程的局限性已經被認識了幾十年。它們需要一種適應大而動態樣本的成像技術。

進入低溫電子顯微鏡。

低溫電子顯微鏡簡史

低溫電子顯微鏡邁向科學主流的緩慢而緩慢的進展可以用三個部分來講述:

1. 三位傑出的科學家成功地進行了基礎研究。
2. 與基準技術，x射線晶體學的鬥爭。
3. 低溫em的裏程碑式結果預示了一種有吸引力的主流方法。

如果您非常趕時間，沒有時間看一個故事，請查看圖1中的時間軸。

否則,讓我們開始吧。

1.早期障礙:分辨率，輻射傷害和計算

一篇裏程碑式的論文發表在自然1975年，理查德·亨德森(他後來成為分享2017年諾貝爾化學獎的三位獲獎者之一)和奈傑爾·昂溫展示了通過電子顯微鏡獲得的膜蛋白細菌視紫紅質的電子密度圖7Å。[２]

除了證明了跨膜螺旋的存在和顯示膜蛋白有明確的結構，它明確地證明了使用電子顯微鏡研究生物分子的有效性。

然而，在1975年，x射線晶體學使蛋白質結構在< 3 Å處得到了解決，盡管其數量遠不及我們今天看到的那樣多

由於低信噪比，從電子顯微圖重建分子的高分辨率圖像是必要的，而這種類型的電子探測器在當時根本不存在。

增加電子的劑量並不是一個可行的解決方案，因為它會破壞精致的生物樣本，使其無法使用。

所以，追逐決心實際上就是在追逐自己的尾巴。我們需要的是另一個分水嶺式的發現。

它是從一個斜角來的。固態物理學。

不結冰的冷凍水:玻璃化

玻璃化的水是快速冷卻它，使它變成固體而不形成冰的過程。在有生物標本存在的情況下，緩慢冷卻的水會對它們造成傷害和變性。這顯然會破壞冷凍電鏡樣本。所以,你必須玻璃化他們。

問題是，這確實很有挑戰性。當我們的目標是製造一層超薄的玻璃化水，將脆弱的生物分子封裝在其自然狀態下時，情況就更糟糕了。

生物樣品玻璃化可以通過以下三種方式提高采集數據的分辨率:

1. 減少入射電子造成的輻射損傷。
2. 保護樣品不受顯微鏡內部真空的影響。
3. 將水分子鎖定在原生樣品周圍。

記住，水分子是樣品四元結構的一部分。

兩個重大發現接踵而至

1981年，Jacques Dubochet和他的實驗室成員發表了一篇論文，展示了一種利用液態乙烷(回顧一下在電子顯微鏡中樣品厚度的重要性)．[3]

然後，在1984年，同一個小組發表了一篇論文，展示了嵌入在一層玻璃化水(也稱為無定形冰)中的單個未受損病毒顆粒的冷凍電子顯微照片。[4]

由於這些努力，雅克·杜波切特也分享了2017年諾貝爾獎。

這是拚圖的兩個部分:

1. 電子顯微圖可用於構建生物分子的電子密度圖。
2. 低溫技術可以用來嵌入和保存精致的樣品。

但如何是從噪聲電子/冷凍電子顯微圖產生的高分辨率電子密度圖?

單粒子分析

這項榮譽歸於約阿希姆·弗蘭克，他在1975年單獨發表了一篇標題謙遜的論文:非周期物體的低曝光電子顯微照片的平均”[5]單粒子分析正如現在所知。

該研究為獲取大量非晶體生物分子的噪聲顯微數據並對其進行平均，以最大化可用數據並最終轉化為電子密度圖提供了框架。

和用x射線衍射得到的地圖一樣。

由於這項工作，他進一步分享了2017年諾貝爾化學獎。

這就是結果。三個獨立的諾貝爾科學壯舉準備給分子生物學帶來革命，就像PCR在不久之後所做的那樣。[6]

然後，似乎什麼都沒發生。事實上，低溫電子顯微鏡被嘲笑為“blobology”，因為它提供的數據分辨率相對較低。[7]

2.進入主流:冷凍電子顯微鏡獲得諾貝爾獎

好吧，這並不是說這項技術被拋棄了它隻是沒有被采用。事實上，這是很久以後的事了。原因有以下幾點:

時間就是一切

首先是時機問題。我們已經提到了x射線結晶學，我也提到了PCR革命，它擴大了樣品結晶的瓶頸。

你的樣品不會結晶嗎?把它拴在一個可結晶的伴侶上，把它切成一個單獨的結構域，變異柔性環，把它變成一個嵌合體，把所有這些都做成一個庫，試著把它們全部結晶。

質粒和重組DNA技術也使x射線晶體學樣品能夠使用我們今天認為理所當然的表達係統生產。以前，樣本是從大量的自然資源中提取的。這是一種混亂的、可能相當難聞的、低效的、有限的做事方式。

電子探測器不足

第二個是硬件問題。具體來說,電子探測器。你看，低信噪比和低對比度顯微照片是低溫電子顯微鏡的主要問題。為了在研究界關心的分辨率下生成足夠的模型構建所需的電子密度圖，您真的需要獲得盡可能多的可用數據。

所以關鍵是這個問題，理查德·亨德森將高分辨率低溫em結構的巨大增加歸因於2008年引進直接電子探測器．這些探測器可以處理係統噪聲，並產生更清晰的顯微圖像，使粒子更容易分類。

計算能力不足

第三個問題是計算能力。準確地說，是缺乏計算能力。從成千上萬粒粒子的顆粒圖像中生成電子密度圖需要大量的計算能力。

究竟有多少計算能力取決於幾個因素，包括被分析的粒子數量、它們的尺寸、對稱性以及收集數據的分辨率。[10]

即使在今天，我們的智能手機擁有比十年前的個人電腦更快的多核處理器，通過低溫em解決結構需要大量的計算能力。

使用單粒子分析構建電子密度圖可能需要數千小時的處理器時間。此外，利用超級計算機集群的成本可能很高。

難怪它花了幾十年才流行起來。

然而，它確實流行起來了，原因不難理解。參觀電子顯微鏡數據庫(EMDB)，並選擇一年。我選擇2015年是因為這是最近的一年，但是之前諾貝爾獎頒發了。

在那一年的640次沉積中，90次與病毒有關，40次與包括鞭毛馬達部分在內的細胞成分有關，105次與重為> 1 MDa的樣品有關。

那一年排名前三的期刊是科學(75年出版),自然(66年出版)PNAS(53出版物)。

3.革命:冷凍電子顯微鏡的現代應用

那麼，為什麼低溫電子顯微鏡能獲得諾貝爾獎呢?

好吧，看一看!以下是冷凍電子顯微鏡實現的十個令人難以置信的結構(表1)。

注意，對於脂質體中包埋的膜蛋白，相應的大小不包括脂質體。對於由相同多肽鏈組成的病毒樣本，大小對應其原子上唯一的部分。組織的大小是基於其組成蛋白的估計分子量。鞭毛質譜環的大小由60 kDa FliF亞基的34個拷貝推斷。牛氣管纖毛是從天然來源分離出來的，所以分子量是無法得到的。

為了你們的觀賞樂趣，我渲染了一些這些結構的圖片。請在下麵的圖2中查看它們。

到2021年，就有了低溫em結構的整個鞭毛馬達，[11]，但我粗略的圖像製作技能可以不做到公正!

如果這還不能說服你看看與COVID-19相關的結構，看看有多少是用電子顯微鏡解決的．(抱歉，但那個幽靈出現隻是時間問題。)

另外，人們對這項技術的興趣急劇上升意味著你現在可以與外部機構合作，他們支持你的冷凍- em項目！

結束

至少現在是這樣。

如果有一個跨學科思考的好處的例子，你剛剛讀過它!

我們已經接觸了固體物理、計算機科學、圖像和信號處理，所有這些都是為了追求分子生物學的目標。

大腦、時機和傳統的運氣在冷凍- em技術的興起中發揮了一定的作用。

現實地說，我們中幾乎沒有人有希望獲得諾貝爾獎，但我們或許都可以從我們自己的特定學科中受益。

如果你喜歡冷凍電子顯微鏡的短暫曆史，請聯係我們!我相信你們都有很多有價值的見解和趣聞要補充，所以一定要在下麵的評論區留下他們!

參考文獻

1. 加利年代(2014)x射線晶體學:諾貝爾獎的一個世紀．J化學建造91: 2009 - 12
2. 亨德森R和昂溫PN (1975)通過電子顯微鏡獲得紫色膜的三維模型．自然257: 28-32
3. Dubochet J和McDowall A (1981)用於電子顯微鏡的純水玻璃化．J Microsc124: 3 - 4
4. 阿德裏安M，杜波切特J和勒鮑J等．(1984)病毒的冷凍電子顯微鏡．自然308: 32-6
5. 弗蘭克·J (1975)非周期物體的低曝光電子顯微照片的平均．Ultramicroscopy1: 159 - 62
6. 朱Het等．(2020)PCR過去，現在和未來．生物學技術69: 317 - 25
7. Saibil人力資源(2017)Blob-ology and biology of cryoo - em:訪談Helen Saibil．BMC醫學雜誌15: 77
8. Dauter Z和Wlodawer A (2016)蛋白質晶體學研究進展．蛋白質Pept列托人23: 20110
9. Monya B (2018)冷凍電子顯微鏡可以觀察到形狀．自然561: 565 - 67
10. Sigworth F (2016)低溫em單粒子圖像處理原理．顯微鏡65: 5767
11. 譚傑，張旭，王旭(2021)細菌鞭毛馬達裝配及轉矩傳遞的結構基礎．細胞184: 2665 - 79