更好的質粒純化:你的質粒產量低的11個原因

在進行質粒製備時，獲得良好的質粒產量是至關重要的。那麼什麼是好的收益率呢?你如何優化你的準備以獲得良好的質粒產量，是什麼導致產量低?我們將在下麵討論這些問題。

什麼是質粒製備的高產量?

有三種主要類型的質粒準備:mini, midi和maxi。質粒DNA的數量在方案和試劑盒之間有所不同，但表1提供了這三種不同製備方法的平均範圍。

表1。質粒製備的平均產量。

質粒產量低的原因是什麼?

Bitesize Bio的讀者Sonia向我們提出了這樣188bet手机版APP一個問題:“當兩個樣本以相同的方式同時處理時，一個樣本的產率很好，而另一個質粒的產率很差，這可能是什麼問題?”

這是一個很好的問題，因為許多因素都會導致質粒製備體的產量不同。讓我們一點一點地解開這個謎，看看為什麼在準備質粒時，你可能會得到低產量的原因，以及你能做些什麼。

1.有問題的插入

你用完全相同的方法同時製備了兩個質粒，但得到了不同的產量。如果質粒有相同的主幹(也就是說，它們都是pUC，或pBluescript等)，那麼原因可能是插入物發揮了作用。

一些插入物可能會對細菌造成問題。可能是產生了一種使細菌生病的蛋白質(例如，dna酶)，也可能是插入不穩定(例如，重複序列)。

為了克服這個問題，可以嚐試使用一種專門的勝任細胞係。對於不穩定的插入，請嚐試STBL2來自生命科技公司的細胞，以及用有毒蛋白質培育克隆體，試試T7表達LysY /智商來自NEB的感受細胞。

另一個重要的點是插入的大小如何改變質粒的拷貝數。大量的插入將減少質粒的拷貝數，這意味著你可能需要培養更多的細胞來獲得像樣的產量。

2.拷貝數

如果基因被克隆到不同的載體上那麼問題可能是質粒以不同的速率複製。一個可能是高拷貝質粒，另一個可能是中拷貝甚至低拷貝質粒。

一些低複製質粒的例子是那些使用骨幹pBR322和pACYC，它們是較老的，不經常用於今天的克隆工作。許多用於蛋白質表達的載體是中複製。這是可取的，因為有時在生產蛋白質時，如果生長過快，就會增加蛋白質變得不可溶或形成包涵體的機會。

3.文化過飽和現象

精心準備文化，你總會得到最好的結果。從舊菌落接種或培養物過於飽和會導致質粒複製和保留不良，嚴重影響質粒產量。

一夜培養似乎很省時，但一夜培養很容易過度飽和，導致低產量。你想要你的培養物處於後期滯後階段而不是過度飽和。

下麵提供了過夜培養的替代解決方案。

增長不飽和培養物的簡單協議

這是針對middiprep的，但也可以針對其他準備類型進行調整。

• 開始於一個新鮮的殖民地，剛出生沒幾天。
• 早上用菌落接種5ml LB發酵劑，培養至OD600約為1，然後放入冰箱過夜。
• 如果你使用氨苄西林作為選擇載體，將細胞製成小球，並在新鮮的、不含抗生素的培養基中重懸，以去除分泌的β -內酰胺酶。
• 次日上午，從發酵劑中取出1ml，接種100ml LB培養物，高拷貝數質粒接種，低拷貝數質粒接種量加倍。
• 培養至OD600約為3，然後將細胞製成小球，直接放入微型準備液中，或將細胞冷凍在-20°C，稍後繼續。

如果你確實想或需要培養過夜，試著用1:1000稀釋的發酵劑進行大規模培養(100 μl變成100 ml)。

提醒一下，培養狀態對於高產量質粒是至關重要的。為了獲得最大產量，培養應在原木後期或固定前期。如果培養物過度生長，你將收獲比活細胞更多的死亡細菌，這也會導致在準備過程中基因組DNA汙染。如果培養物未生長，那麼，當然，產量會低於預期。

4.Undergrowing文化

雖然過度飽和是個問題，但培養物的下層生長對質粒產量也是個問題。你可以錯誤地通過使用盤子裏的舊菌落或直接從冷凍股票而不是菌落中開始培養一種文化。當你使用這兩種方法中的任何一種時，細菌增長的延遲時間都要長得多。

4.用舊殖民地

還有一點，人們在設置發酵劑培養物或隔夜培養物時忘記了，那就是你用來挑選菌落的盤子的年齡。如果你的盤子是舊的，你可能選擇了一個漂亮的大菌落，但它不會都是活細胞。如果在原來的菌落周圍有衛星菌落而原來的菌落中抗生素已經不存在了，那麼這些菌落就不會有質粒，就會被引入到你的培養中。所以，在開始之前，先在盤子上抹上幾道線，以確保達到最好的效果。

5.抗生素的問題

診斷質粒產量低的一個重要考慮因素是抗生素。當細菌在培養基中生長時，它們會分解抗生素。

如果沒有添加足夠的抗生素，或者如果原液是舊的，沒有正確的強度，抗生素的選擇壓力可能不會持續很長時間，你可能會得到一個在大部分培養時間裏都不含抗生素的培養。

在沒有選擇壓力的情況下，質粒產量會下降，因為它們需要能量來複製。

氯黴素:提高質粒產量的簡單方法?

許多常用的載體有一個寬鬆的複製起點，這允許將一般蛋白質合成與質粒複製分離大腸杆菌。添加氯黴素會阻止蛋白質合成，但質粒會繼續複製。這將導致每個細菌基因組產生更多的載體拷貝。

我說的鬆弛起始質粒有pMB1或ColE1複製起點。最常見的帶有這個原點的向量主幹是(按每個細胞副本的降序排列):

• 舉辦的
• pGEM
• pBR
• pACYC -確保你的衍生物對氯黴素沒有抗藥性，因為這將使添加任何濃度的抗生素無效。

有更多的鬆弛起源質粒也是如此。

有兩種方法可以使用氯黴素進行質粒擴增。

1.根據《狂人》的說法，使用氯黴素

這是Maniatis的經典食譜等，也就是“狂徒”。¹

Maniatis建議培養至飽和，然後加入170µg/ml氯黴素，繼續培養16小時。你將在已經密集的培養基中完全停止蛋白質合成。細胞會停止生長，但載體會繼續擴增。

2.貝格比建議使用氯黴素

Begbieet al。探索了另一種更快的可能性。²在之前的方案中，培養培養基需要至少36小時。

另一種方法是當你用發酵劑接種主培養物時，添加濃度低得多的氯黴素，3微克/毫升。亞抑製濃度會稍微減慢你的大腸杆菌翻番的時間，卻不會停止它。然而，它會使向量的拷貝數增加幾倍。

不管你使用氯黴素擴增載體的方式如何，都要將培養物視為含有高拷貝數載體。首先，不要在中柱或大柱上放置過多的裂解液，按照規程使用最小的培養體積。用最大體積的緩衝液洗脫，重複洗脫。你可以稍後再濃縮DNA。

6.溶解和中和的問題

尼克已經研究過堿解在非常詳細的情況下，通常這些試劑在中期準備試劑盒是穩定和良好的。溶液2(含有NaOH和SDS)暴露在空氣中會隨著時間的推移而分解，所以如果它是舊的，這可能是一個問題。一般來說，它們在試劑盒的整個生命周期內都在裂解細菌。

人們在質粒製備過程中犯的最大錯誤是裂解和中和步驟。協議通常強調溫和的重要性，以防止基因組DNA的剪切，但我發現人們往往太溫柔。

另一個常見的問題是，裂解被允許進行太長時間，導致永久變性，不可消化的DNA。

這裏有一些改進裂解和中和步驟和增加質粒產量的提示。

• 使用低拷貝數的質粒?使用雙倍推薦量的再懸浮、裂解和中和緩衝液。這也可能有助於高複製質粒，而這些質粒在過去的產量較低或裂解不良。
• 加入裂解緩衝液後，不采用方案中推薦的4-6反轉，而是將試管倒置，輕輕混合3分鍾，然後立即加入中和緩衝液。
• 將中和緩衝液輕輕倒置，連續攪拌1分鍾。
• 如果沉澱物看起來像幹燥的椰子，那麼情況看起來不錯。如果它看起來黏糊糊的，那就不好了。試著通過混合來打破粘稠，這次稍微用力一點(但仍然相當溫和)，繼續攪拌1分鍾。
• 如果這一坨仍然沒有分解，那麼收益率很可能很低。下一次使用上麵描述的雙緩衝卷。

7.異丙醇的質量

許多實驗室都有裝在大型容器裏的異丙醇，這些容器在一年的時間裏被打開和關閉。為了在沉澱步驟中取得最好的結果，確保所用的異丙醇不是舊的底層原料。

用一些新瓶裝的異丙醇，或者用不知道有多少年曆史的小瓶裝的異丙醇。這使得離心後得到的DNA顆粒的大小有了很大的不同，因此，質粒的產量也有了很大的不同。想要了解更多關於沉澱的工作原理，以及乙醇和異丙醇之間的區別，請閱讀我們的文章DNA沉澱:乙醇與異丙醇．

8.輸了球

異丙醇顆粒呈透明玻璃狀，很難看到。最好的做法是標記管的一邊，你希望在固定角度的轉子離心後形成球，所以當你潷析異丙醇;你知道去哪裏找。

另一種方式，以確保你知道你的球是什麼時候使用固定角度轉子是加載你的管在一個相同的方式(相對於離心機的中心)，然後你的球應該總是在同一個地方。

注意觀察現場，尋找玻璃材質。有時這是困難的，因為許多人使用Oakridge塑料管是不透明的。如果你有玻璃芯管，這是一個很好的替代品，他們可以烘烤，使他們無熱原。

有時，如果你擔心失去顆粒，最好的做法是將異丙醇上清液倒入15毫升的管子中保存，以防顆粒從管壁滑落。但隻要在離心機停止後不讓樣品停留太久，這種情況通常不會發生。一旦完成，就在那裏倒樣品。我唯一一次看到顆粒從牆上脫落，是在我去離心機的時候遲到了，它一動不動地呆了幾分鍾。

無論你是用橡樹嶺管還是玻璃管，隻要注意到顆粒應該在哪裏。一旦你用70%的乙醇清洗，顆粒變得可見。當你準備重懸你的子彈時，你會知道在哪裏找到它，因為你在管子上做了標記。

謹慎!它並不總是一個小球!

有時固定角度的轉子，DNA不一定能在側壁形成一個緊密的小顆粒。有時會弄髒側麵。因為這個原因，我總是用我的重懸緩衝液清洗我的顆粒上方的牆壁，以確保我溶解了每一個可能存在的質粒分子，即使我看不到它。

如果你有合適的適配器，你可以使用一個擺動桶轉子離心機，整個球團是在管的底部，而不是在一邊。要了解更多關於轉子選擇如何影響球團放置，請觀看埃賓多夫離心機基礎知識網絡研討會．

做了所有這些工作，然後在最後失去了DNA顆粒，這是一種恥辱!更多關於完美的DNA顆粒回收的提示也在這裏．

我認為有必要提一下，許多質粒試劑盒製造商已經認識到，對一些用戶來說，造粒步驟是有問題的，因此開發了使用“沉澱器”或二氧化矽圓盤過濾器淡化DNA的試劑盒。這是離心分離法的快速替代方法。然而,你仍然這些東西需要好的異丙醇，所以要用新鮮的。

9.離心太短或太慢

我們很愉快地討論了DNA降水在以前的文章中，它是一個共識，獲得高產量的最重要的因素是離心速度和時間。除非你能加快速度，否則不要縮短離心機的時間。

10.列會被阻塞

如果你使用離心分離法去除沉澱碎片，在將上清液塗到色譜柱上之前，要先用Whatman紙過濾上清液，因為少量的沉澱很容易堵塞色譜柱。

11.DNA未完全洗脫

洗脫後，DNA可以留在色譜柱上。為了捕獲任何剩餘的DNA，進行第二次洗脫，將其放入一個單獨的集合中。使用加熱到50°C的洗脫緩衝液也有助於提高洗脫收率。

質粒產量總結

質粒DNA準備有很多可能出錯的步驟，但根據我的經驗，問題通常不是培養，就是DNA沉澱。如果你的質粒製備體產量低，你可以采取一些步驟。

為了檢查你的培養是否適合大規模的準備，隻需從燒瓶中取出1-2毫升，然後快速地做一個小型準備，看看有多少質粒/毫升。這將使您對從其餘樣本中得到什麼有一個很好的概念。

所以記住要獲得高的質粒產量，首先對載體做一些背景研究，插入以確保DNA本身不會有問題，然後從一個新的菌落開始，開始培養和新鮮的抗生素。最後，新鮮的異丙醇將是徹底沉澱所有質粒DNA的關鍵。

最初發布於2014年5月12日。2022年3月審查和更新。本文中的內容包括來自維姬Doronina而且尼克·奧斯瓦爾德．

參考文獻

1. T. Maniatis, E. Fritsch, E. F.和J. Sambrook。分子克隆．紐約:冷泉港實驗室;1982.頁545。
2. Begbie年代。et al。(2005)氯黴素亞抑製水平對大腸杆菌DH5?．《實驗微生物學與免疫學雜誌》。7:82-8。