如何選擇全血DNA提取方法

在過去的幾十年裏，PCR、下一代測序和微陣列技術將基於血液的研究提升到了一個新的水平。現代基於血液的應用包括DNA指紋、全基因組測序、血庫到液體活檢等等。無論應用如何，從全血中提取純的、完整的、雙鏈的、高濃度的DNA是這一領域成功的必要前提。

您選擇的全血DNA分離技術不僅影響您的結果，還影響您的分子生物學工作流程的便利性。與許多其他科學技術一樣，選擇提取方法本身就是一個挑戰!實驗室通常有自己首選的經過試驗和測試的方案。用於溶解細胞和選擇性分離DNA的化學物質的設置和具體方案可能有所不同。然而，幾乎所有可用的全血DNA分離方案都涉及這些常見步驟:細胞裂解，去除蛋白質，其他汙染物和RNA，以及(最後)DNA恢複。本文將幫助您了解從全血中分離基因組DNA的不同方法。

DNA提取程序-沉澱化學

采用沉澱化學分離全血DNA的工作原理是通過高鹽濃度和添加酒精(乙醇或異丙醇)從裂解液中沉澱DNA。這種方法很容易將DNA從其他可能幹擾下遊應用的生物分子和有機化合物(如脂類和碳水化合物等大分子)中分離出來。該方法還將從血液中可能存在的任何外源添加的化合物中分離DNA(例如藥物發現項目中的新化學實體)。我們可以進一步細分沉澱化學方法為一步或兩步裂解方法。

兩步溶菌作用:

在兩步裂解法(用於Puregene包)，第一步使用洗滌劑溶解紅細胞，如十二烷基硫酸鈉(SDS)和Triton™X-100。然後，第二步確保白細胞裂解以釋放細胞核、基因組DNA和RNA(圖1a)。核糖核酸酶處理(通常使用RNAse A)然後去除汙染的rna，將DNA和蛋白質分子留在上清液中。

下一步是使用濃縮鹽去除蛋白質，從裂解細胞中沉澱蛋白質。由於鹽的加入，陽離子濃度增加，自由水變得更少，蛋白質的溶解度降低，導致蛋白質“鹽化”。然而，DNA仍保留在收集的上清液中。

一步裂解:

在一步裂解法(用於FlexiGene包)，紅血球和白血球會在一個步驟內裂解;這是通過一種能夠溶解兩種細胞的洗滌劑混合物來實現的。這個裂解步驟釋放原子核和線粒體通過離心收集白細胞，將RNA留在上清液中(圖1b)。

與一步法(純基因法)一樣，下一步是去除汙染蛋白。在這裏，白細胞核和線粒體用變性緩衝液處理，其中含有朝性鹽和蛋白酶。這同時使細胞核和線粒體中的蛋白質變性和消化，將消化後的蛋白質和基因組DNA留在溶液中。

在這兩種方法，通過酒精沉澱回收DNA，並使用Tris或Tris- edta緩衝溶液再水化。分離的DNA在4°C和-20°C下穩定10年以上。

與傳統的兩步裂解法相比，一步裂解法具有許多優點:

• 最重要的是，對於你的DNA產量，它消除了可能的樣本損失，可以在一個兩步程序。
• 無需更換管(即，對於手動程序，樣品混合的風險大大降低)
• 它節省了你在實驗室的時間，因為步驟更少，沒有過夜的孵化或清理步驟。例如，兩步沉澱化學法需要48小時才能將DNA溶解。
• 一步裂解方法對實驗室的預算也很友好。它更便宜，因為它不需要額外的酶，如RNase，或任何額外的設備。

用磁珠提取DNA

磁珠捕獲是提取DNA的最新方法。使用磁珠分離全血DNA的工作原理是將DNA捕獲在塗有二氧化矽基質的磁珠上，以結合核酸。

與沉澱化學方法一樣，全血細胞首先必須使用SDS或類似的洗滌劑進行裂解。下一步是將裂解細胞和磁珠混合，讓DNA與磁珠結合。

在磁場下進行幾輪清洗，然後將磁珠上捕獲的DNA與其他未綁定的細胞汙染物分離。然後，低鹽緩衝液將DNA從珠子中洗脫。

一些研究，包括Carpi的一篇綜述et al。，表明磁珠可以是最快的方法。¹然而，這種速度是有代價的——金錢上的，DNA產量和純度上的。²磁珠方法可以使DNA產量減少20%。此外，任何磁珠遺留汙染你的DNA樣本和幹擾下遊應用。最後，它是最昂貴的方法，因為它需要磁捕獲支架、板和磁珠。

臨別前的忠告

無論你選擇哪種方法，事情都可能出錯。以下是一些有用的提示，您可以結合它們來確保高質量、高產量的全血基因組DNA用於您的下遊應用:

• 做一個初步實驗。在開始一項有大量樣本的新技術之前，先從小處著手。你將發現陷阱在哪裏，你將能夠在花費大量時間和金錢在真正的實驗上之前優化你的程序到完美。

• 使用DNA防腐劑。近年來，市場上出現了大量的DNA穩定試劑。這些液體試劑可以在分離後立即添加到血液樣本中，以抑製核酸酶活性和潛在的汙染微生物。這使你可以長時間儲存未處理的血液，而不必擔心DNA降解。另一個好處是你可以一起處理一個實驗的所有樣本，從而減少了變化的來源。一些市售產品要求在下遊應用前去除穩定劑，所以要注意這一點!

• 正確定量你的DNA。基因組DNA製劑中汙染物、降解DNA和RNA的存在會影響檢測結果。不幸的是，如果依賴於一種量化方法，你可能並不總是能抓到這些入侵者。因此，在開始耗時和昂貴的下遊應用之前，使用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳的組合來可視化和量化基因組DNA是明智的。

• 利用在線社區。網上有很多其他科學家提供的幫助，他們可能已經解決了困擾你的確切問題。ResearchGate，網絡協議而且LinkedIn組都值得一看。類似地，來自供應商的技術支持是故障排除和一般建議的另一個優秀資源。

最後……

生物技術、細胞生物學、生物化學和生命科學的進步讓我們在實驗室裏有了更多的選擇。現在，似乎什麼都有一個工具包!然而，就像從結構生物學到分子生物物理學的幾乎所有實驗室技術一樣，每種方法都有自己的優點和缺點。這裏介紹的協議概述和提示應該有助於您選擇全血DNA提取的方法。

適合你的研究的正確技術可能是為你提供最容易和快速的質量DNA。

想知道更多關於DNA提取的知識嗎?閱讀我們的相關文章DNA提取方法是如何工作的．

參考文獻

1. Carpi FM, Di Pietro F, Vincenzetti S, Mignini F, Napolioni V.(2011)人類DNA提取方法:專利和應用。近期Pat DNA基因序列．4月,5(1):1 - 7。
2. 查康-科爾特斯D，格裏菲斯LR。(2014)從全血樣本中提取基因組DNA的方法:目前的觀點。應用醫學生物儲存庫科學雜誌．2: 1 - 9。