新英格蘭Biolabs，Inc。（NEB）成立於1970年代中期，是針對分子生物學應用的發現和生產的行業領導者，現在為基因組研究提供了最大的重組和本機酶選擇。NEB繼續將其產品擴展到與PCR，基因表達，下一代測序的樣品製備有關的領域，合成生物學，糖生物學，表觀遺傳學和RNA分析。此外，NEB專注於加強聯盟，使新技術能夠到達關鍵市場領域，包括分子診斷開發。新英格蘭Biolabs是一家私有公司，總部位於馬薩諸塞州伊普斯維奇，通過獨家分銷商，代理商和位於加拿大，中國，中國，德國，德國，日本，新加坡，新加坡和英國的獨家分銷商，代理商和七個子公司的網絡進行了廣泛的分銷。有關新英格蘭Biolabs的更多信息鼻。
EMSA - 教老狗新技巧
內容由新英格蘭Biolabs
探測與EMSA的核酸 - 蛋白質相互作用
電泳遷移率轉移測定法（EMSA）是一種用於檢測核酸 - 蛋白質複合物特異性結合的強大技術。在過去的30年中，EMSA一直是研究核酸（DNA或RNA）和核酸結合蛋白之間定性相互作用的“去測定”。通過使用無線電標記的探針，可以比較信號在聚丙烯酰胺凝膠上的位置以確定定性相互作用。此外，隨著計算機和光學成像技術的新進展，EMSA已將其作用從僅定性變為定量測定。
轉移我們對EMSA的理解
凝膠電泳是一種基於分子量的一組核酸或蛋白質的常用方法。通常，一個運行核酸時使用瓊脂糖凝膠。另一方麵，聚丙烯酰胺凝膠通常用於分離蛋白質。EMSA利用了一個事實，即在凝膠電泳中均勻的電場的條件下，大型核酸 - 蛋白質複合物將比單數蛋白慢得多（圖1）。為了解釋這一點，讓我們看一下蛋白質遷移。說蛋白質X是一個基本單元（單體），它能夠與其他蛋白質X相關聯，形成一個稱為四聚體的較大複合物。與同一電場下的凝膠電泳實驗中的單體相比，四聚體的運行始終要慢得多。
如果您將相同的原理應用於DNA結合蛋白，則如果存在特定的DNA-蛋白質複合物，則在凝膠電泳後的帶遷移會發生變化。通常用射電標記的DNA探針檢測DNA-蛋白複合物的帶遷移，以檢測序列特異性相互作用。這些探針通常由您正在檢查的線性綁定序列組成。您可以選擇標記前麵（5'）或背麵（3'） - 線性探針的末端，使用射線活性同位素（例如磷酸鹽-32）（32P）。電泳後，通過暴露於X射線膜來可視化凝膠。為了更確定特定蛋白與DNA結合，研究人員還可以添加對複合物中核酸結合蛋白特異性的單克隆抗體，從而產生“凝膠超速移動”。
順便說一句，如果您仍然對如何運行蛋白質分離凝膠感到困惑，請查看以下文章：
- SDS-PAGE如何工作（//www.mobtapp.com/580/how-sds-page-works/）
- 變性的性質（蛋白質凝膠，就是！）（）（//www.mobtapp.com/20794/the-nature-of-denaturing-protein-gels-that-is/）
還有一些研究蛋白-DNA相互作用的方法。例如，如果您想表征DNA蛋白複合物，則可以采用免疫沉澱（或DNA下拉），涉及使用用磁珠標記的二抗。可以通過通過磁柱純化樣品（拉下）。此外，有時可以將更專業的染色質免疫沉澱測定法（芯片）代替EMSA。
圖1. EMSA的簡化版本。泳道1：僅陰性對照（DNA），泳道2：不結合的蛋白質 + DNA，泳道3：陽性對照。來源：來源：https://commons.wikimedia.org/wiki/file%3agel_shift_assay.png
多年來發生了什麼變化？
A.檢測方法的類型
- 放射性探針與。熒光探針。正如我在上一段中提到的那樣，在過去，無線電標記的核酸探針用於EMSA檢測。通常，這涉及使用磷酸鹽32的5'（前）或3'（後）端標記。盡管凝膠轉移測定的主要機製保持不變，但已經開發了新的檢測試劑。如今，我們需要遠離可能傷害自己並汙染環境的放射性材料。取而代之的是，研究人員使用基於熒光色素的染料或基於熒光素酶的發光係統。這些新係統不僅在我們的健康和環境方麵更安全，而且比放射性設置更精確，並且往往會產生較少的背景噪聲。要使用熒光色素探針，您需要一個具有激發光源（即激光器）的光學圖像捕獲係統。通常，這些成像設備由兩個部分組成：1）數碼相機係統，以控製圖像的焦點和暴露；和2）廣泛的光源（從超紫羅蘭到具有不同激發波長的激光器），以補充市場上不同種類的熒光染料。通過適當的技術，您可以通過此成像係統獲得出色的結果。
- 化學發光EMSA。通常，這種試劑試劑盒為您為您標準化實驗提供了生物素標記的受控DNA和核提取物控製集。如果您使用適當的檢測設備，化學發光反應可提供明確而強的信號。輕微的缺點是您需要生物素化自己的DNA模板（感興趣的目標）。但是您不必擔心：通常可以從商業來源定製DNA寡素。
- SYBR綠色核染色和蛋白質紅色汙漬。幾個實驗室已成功使用了EMSA的商業試劑試劑盒（1,2）。這些試劑盒旨在通過顏色分離核酸和蛋白質。核酸將被染色綠色，蛋白質將被染色為紅色。因此，當兩者形成複合物時，最終顏色將為黃色。同樣，您可以在商業光學成像係統上可視化結果。這是一個快速簡易測試的非常整潔的測定，尤其是靶核酸的標記不是最好的選擇。
B.檢測蛋白質核酸複合物的其他方法
- 快速瓊脂糖凝膠電泳。由Lewis KA領導的研究小組使用瓊脂糖凝膠（3）開發了一種新方法，該方法比傳統SDS-PAGE使用的聚丙烯酰胺更容易製作和執行。此外，該組能夠減少運行時，並且仍然通過高壓運行來獲得高分辨率數據，這與凝膠電泳101上的當前智慧相反。通常，增加電壓可能會導致塗抹效果。
- 微流體VS。96孔板微陣列。還有一些更多的專業測定法。例如，活化B細胞的NF-KB（核因子Kappa-Light-light鏈 - 鏈）檢測試劑盒使用固定的目標序列DNA進行高吞吐量篩選（4）。它以96孔板格式很好地工作。可以添加您的樣品核提取物，並使用能夠檢測核-DNA複合物的單克隆抗體檢測到陽性結果。
另一種潛在的高吞吐量方法涉及使用微流體芯片，這些芯片設計用於分離不同尺寸的DNA片段。由史密斯等人領導的研究小組。Al報告說，DNA蛋白複合物也可以使用這些微流體設備分離（5）。
結論：
EMSA在DNA-蛋白質相互作用上具有如此廣泛的應用，並且仍在添加和修改不同的方案。我迫不及待地想了解有關EMSA如何繼續發展的更多信息！
您使用過EMSA嗎？通過在評論部分寫作，與我們分享您的經驗！
參考
- 凱哈尼等。TATA結合蛋白（TBP）與絲狀昆蟲致病真菌的多蛋白橋接因子1（MBF-1）之間的相互作用Beauveria Bassiana。PLOS ONE。2015年10月14日;10（10）：E0140538。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0140538
- Patton WF等。兩色fluroscence電泳遷移率分析程序的實用性用於分析DNA複製複合物。2004年8月；25（15：2439-46。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15300760
- Ream JA等。快速瓊脂糖凝膠電泳遷移率轉移分析用於定量蛋白質：RNA相互作用。肛門生物化學。2016年10月15日;511：36-41。
- Piper J.（2011年3月）。範式凝膠轉移[網絡日誌帖子]。從2019年3月檢索https://www.the-scientist.com/technology/paradigm-gel-shift-54966
- Clark J等。微流體芯片的移動班次分析。生物技術。2003年9月；35（3）：548-54。