中巴經濟走廊——快速廉價的克隆戰略

克隆策略-有很多選擇

分子克隆技術已經從簡單的限製性消化-連接克隆策略發展到大量高效的克隆策略選擇．從廣義上講，克隆技術可分為序列依賴策略和序列獨立策略。

序列依賴策略是基於限製性消化-連接技術或位點特異性重組。它們需要在插入或向量或兩者中都存在的獨特和特定的位置。因此，它們不便於多片段克隆，因為在序列的多個位置存在特定的位點是困難的。序列依賴克隆策略的例子包括單載體質粒載體係統和網關克隆．

Sequence-independent策略都是基於同源重組。這需要矢量和插入的互補單鏈懸垂。生成懸垂物需要額外的步驟、酶和大量的起始DNA物質。因此，這些策略既耗時又昂貴。此外，它們並不總是嚴格的序列獨立，因為一些技術需要重疊區域的某些核苷酸。而序列無關克隆技術是多片段組裝和構建複雜DNA文庫的最佳策略。一些例子包括:助教克隆，結紮獨立克隆(LIC)無縫連接克隆提取液(SLiCE)、交配輔助基因整合克隆(MAGIC)、序列和連接獨立克隆(SLIC),在融合，吉布森組裝，聚合酶不完全引物延伸(PIPE)和環狀聚合酶延伸克隆(CPEC)。

雖然所有的克隆技術都以相似的起始材料開始，以相同的產物結束，但在時間、步驟數、成本(取決於使用的酶的數量)、錯誤和突變率以及克隆的準確性和效率方麵都有所不同。因此，策略的選擇取決於大量用戶定義的因素。

中巴經濟走廊——有什麼新消息?

CPEC是用於一步聚合酶鏈反應中組裝多片段複合體文庫的許多序列無關克隆技術之一。它使用一種酶，與其他使用多種酶和步驟的策略相比，它既便宜又省事(圖1)。該技術發生在單步反應中，使其快速方便。那麼，你將如何著手中巴經濟走廊?

如何中巴經濟走廊?

1. 使用限製性酶切或PCR擴增使載體線性化，就像正常克隆一樣。
2. 將插入設計為在矢量的兩側有雙鏈重疊。為此，在PCR反應中，在插入物的兩端添加約25 bp的重疊序列。向量和插入之間的重疊區域應該有相似的T_米(55 ~ 70°C)進行特定退火。
3. 接下來，將線性化的載體和插入物混合到典型的PCR反應中，無需引物。
4. 使用高保真聚合酶(無鏈置換活性)進行PCR反應，單個插入使用一個循環，根據片段數量和文庫複雜性可進行更多循環(2至25個循環)。在變性和退火過程中，插入物和載體以彼此為模板進行雜交和擴展，形成完整的雙鏈質粒。
5. 在瓊脂糖凝膠上測試一小部分PCR產物以確認組裝。
6. 用PCR產物轉化感受態細胞(聚合酶延伸後，每條鏈上留下一個缺口，可以填充在活的有機體內通過細胞酶)。

特性

CPEC是一種與序列無關的克隆策略，可以很容易地將多個片段組裝到任何載體中，並進行複雜的庫準備(不像Gateway或Univector等依賴序列的克隆)。它的使用也很靈活，不像傳統的克隆或TA在應用上受到限製的克隆。這是一個單步反應，隻使用一種聚合酶(沒有外切酶或連接酶)，這使得它直接，快速和成本效益(Gibson是昂貴的，因為它使用三種獨立的酶，而SLIC或PIPE是兩步反應)。由於沒有外切酶，小片段可以組裝而不用擔心咀嚼回(吉布森組裝的一個限製)。CPEC發生在比SLIC或Gibson更高的溫度下，因此很少形成非特異性雜化和穩定的二級結構。此外，中巴經濟走廊不是一個放大過程，不會積累突變。因此，CPEC具有較高的克隆精度和效率。

限製

與SLIC或Gibson組裝相比，聚合酶衍生的突變是CPEC中一個值得關注的問題。錯誤啟動可能發生在序列的任何地方，而不僅僅是末端。不可能在一個向量中多次複製相同的插入。

CPEC似乎比標準克隆技術以及一些更新的版本提供了令人興奮的優勢。你會在你的實驗室裏試驗中巴經濟走廊，並將其與你現有的技術進行比較嗎?讓我們知道你的經驗!

參考文獻

1. 李敏珍，Elledge SJ (2005);MAGIC，一種用於快速構建重組DNA分子的體內遺傳方法。自然遺傳學37,311-319。
2. 權健，田健(2009);複雜基因文庫及途徑的環狀聚合酶擴展克隆。PLoS ONE 4(7): e6441。
3. 權健，田健(2011);用於高通量克隆複雜和組合DNA文庫的環狀聚合酶擴展克隆。自然協議6,242-251。