迷你準備方法的動物園

多年來，質粒DNA的製備方法五花八門，從簡單的到極其痛苦的，但我懷疑我們大多數人在職業生涯中隻使用過其中的一種或兩種。

在Bi188bet手机版APPtesize Bio，我們生命的使命(部分)是幫助你建立你的分子生物學武器庫，所以在這篇文章中，我將簡要介紹不同的質粒微型製備方法。如果你已經(或已經)嚐試過這些方法中的任何一種，或者如果我有遺漏的方法，請在評論中告訴我們。

堿性裂解法(參考這裏）

這種方法是基於染色體和質粒DNA的裂解和差異變性，以分離兩者(見在這裏更多細節)

裂解使用含SDS的NaOH溶液進行。在這一步驟中，染色體和質粒DNA都被變性，但在使用高濃度醋酸鈉溶液中和後，隻有質粒DNA能夠再生並保持可溶性，而染色體DNA與細胞蛋白、鉀和SDS形成複合物，然後通過離心去除。然後用異丙醇沉澱分離質粒。

這種方法創建的質粒通常適用於大多數應用，盡管測序需要額外的苯酚清理，以確保沒有額外的湯汙染你的反應。

試劑要求:

STE(蔗糖/Tris/EDTA)溶液(可選洗滌緩衝液):
8% (w/v)蔗糖，50mm Tris-HCl (pH 8.0)， 50mm EDTA (pH 8.0)。用高壓滅菌罐保存在4°C。

一種(葡萄糖/三/ EDTA)解決方案:
50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 10 mM EDTA (pH 8.0)。用高壓滅菌罐保存在4°C。

堿性SDS溶液:0.2 N NaOH, 1% (w/v) SDS，(或0.1N NaOH，如果用於測序)

中和解決方案:
5 M醋酸鉀60 mL, 11.5 mL冰乙酸，28.5 mL雙餾水。得到的溶液是3 M醋酸鹽和5 M鉀，pH值約為4.8。在室溫下儲存，不要高壓滅菌

沸騰裂解法(參考這裏）

該方法在小體積培養中製備質粒時快速可靠。雖然這種方法得到的質粒質量低於上述堿性裂解法，但足以進行限製性消化。

裂解是用溶菌酶(0.5mg/mL終液)在STET緩衝液中處理並加熱，使染色體DNA與菌膜和其他蛋白質沉澱，然後通過離心去除。的質粒然後用異丙醇沉澱DNA．

這種方法與大腸杆菌菌株不兼容，大腸杆菌菌株會產生內切酶，當然，除非你增加一個苯酚的額外步驟:氯仿清理。

如果你喜歡微波，你也可以用微波在STET緩衝液中加熱20-25秒來溶解細菌(參考這裏)——不要太熱戀，在微波爐裏東西很可能會爆炸——然後簡單地離心，在冰上冷卻後與異丙醇沉澱。

試劑要求:

STET溶液:8% (w/v)蔗糖，50mm Tris-HCl (pH 8.0)， 50mm EDTA (pH 8.0)， 5
(w / v)特裏同x - 100。過濾-消毒，4℃保存。

矽藻土法(參考這裏）

對於那些熱衷於自製質粒準備套件的人來說，這是為你準備的

製作50g的懸浮液矽藻土(Celite)在500mL dH2O中，讓它沉澱3小時，然後收集固體，以10mg/mL的濃度重新懸浮在DNA結合溶液中(見下文)。

然後在0.5mL的體積中(根據需要放大)，加入1mL DNA結合液，搖勻，室溫下靜置2-5分鍾使其結合。離心10秒，使顆粒成粒，並重新懸浮含有。重複這一步驟，然後用1mL丙酮清洗小球，在65°C下短暫幹燥。加入50-200uL洗脫DNA, 65°C孵育2分鍾。

試劑要求:

DNA結合液:4M硫氰酸胍，50mM Tris pH 7.0, EDTA 20mM(暗處保存，穩定3個月)。
洗滌緩衝液:50%乙醇，200mM NaCl, 10mM EDTA, 50mM Tris-HCl pH 7.4

兩性離子裂解法(參考這裏）

這是一個相對溫和的過程，用於溶解細胞和分離質粒，它依賴於細胞蛋白質的軟聚集，已知含有大量質粒DNA(據推測在其他方法中會丟失)。汙染物和RNA簡單地用洗滌步驟去除，質粒用TE或水洗脫。

將離心後的細胞重新懸浮在pH 8.0的Tris (50mM)， EDTA(10mM)緩衝液中，並在等體積的0.2M NaOH和10µm3 -(十二烷基二甲基氨)丙烷磺酸鹽中孵育至少1分鍾。在離心之前，在骨料中加入1mL由10mM Tris (pH 8.0)和10mM NaCl組成的洗滌緩衝液，然後以最大速度離心樣品，小心地除去大部分上清(需要一些時間來適應)，重複洗滌步驟，或者用TE或dH2O洗脫質粒，然後拋棄蛋白骨料。

利亞姆的質粒的方法

好吧，這個還沒有發表，我也沒有測試過，但我敢打賭一雙舊襪子它像炸彈一樣有效。在寫這篇文章的時候，我想把這些方法結合起來，既快捷、便宜，又不會太髒，會很有幫助。我還添加了一個微調使用精氨酸在裂解緩衝，有被報道能提供更高質量的DNA．這就是我想出來的:

1、在原培養體積的1/3內，用STE緩衝液使球團旋轉和重懸，旋渦使球團旋轉和洗滌，然後以最大速度再次旋轉。

2.用緩衝液1在原培養體積的3/10處旋動顆粒，使其重新懸浮。

3.加入等量的l -精氨酸裂解緩衝液。這可以放置超過正常的5分鍾沒有問題(但不是明顯的一夜)，混合好，但不要旋渦。這種高的，但可控的pH溶液應該導致變性質粒較少，並防止與蛋白質和肽聚糖片段共沉澱，從而更好地在稍後進行限製性消化。

4.用等量5M醋酸鉀(pH 4.75)中和溶液(鋰和醋酸鈉也可以，前提是它們是用等量的醋酸鹽和醋酸製成的)

5.將裂解液以最高速度旋轉10分鍾，然後將上清液轉移到新管中，用0.8體積的異丙醇沉澱血漿DNA，然後在-20℃冷卻15分鍾，或以最高速度直接旋轉

試劑要求:

緩衝1:50mM Tris, 10mM EDTA pH 8.0, 100ug/mL RNase A

l -精氨酸裂解緩衝液:含0.5M l -精氨酸(pH 11.7)的1% SDS溶液

中和溶液:5M醋酸鉀(pH 4.75)

l -精氨酸裂解緩衝液本身可以作為裂解緩衝液的替代品，在商業化的基於柱的方法中(記得回收柱!)，將提供更高的產量和更好的DNA質量

雖然使用l -精氨酸緩衝液會增加少量的成本，但消除酶反應失敗和測序所節省的時間和費用是值得的。

請讓我知道這個方法是否適合你，是的，我將在接下來的幾周內嚐試它，並將在這裏發布比較結果-所以請注意這個空間!

要了解更多關於完成實驗的提示、技巧和技巧，請查看188bet手机版APP咬大小的生物DIY在實驗室中心．